Diseño y evaluación de inhibidores peptídicos dirigidos a la interfaz de dimerización de la tripanotión reductasa de Leishmania Infantum
- Autores: Miguel Ángel Toro Londoño
- Directores de la Tesis: Antonio Jiménez Ruiz (dir. tes.), Federico Gago Badenas (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Alcalá ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Luis Ignacio Rivas López (presid.), Santiago Ramon Maiques (secret.), Helena Castro (voc.)
- Materias:
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- Resumen
- español
Entre las muchas peculiaridades que se encuentran al estudiar los organismos tripanosomátidos de interés clínico, una de las más interesantes desde el punto de vista de la identificación de nuevas dianas terapéuticas es la forma como este parásito destoxifica su ambiente intracelular de especies oxidantes. Al carecer del ubicuo sistema glutatión/glutatión reductasa, en su lugar, el parásito cuenta con un sistema análogo modificado que emplea el tripanotión (T[SH]2), que no es más que dos moléculas de glutatión unidas por un puente espermidina. Esta unión permite que los tioles activos de la molécula se encuentren en más proximidad haciéndola mejor reductor que el glutatión. En el centro del metabolismo del T(SH)2 se encuentra la tripanotión reductasa (TryR), una enzima esencial para la supervivencia del parásito que está encargada de mantener en todo momento un pool de tripanotión reducido dentro de la célula. Esta enzima es un homodímero que cuenta con dos centros activos en los que participan residuos de ambas subunidades, haciendo de su configuración dimérica una característica fundamental para su actividad.
Al sintetizar un péptido que emula una de las hélices ¿ que hacen parte de la interfaz de dimerización ubicada donde ambas subunidades hacen contacto, hemos sido capaces de desestabilizar el dímero de la enzima y minimizar su actividad. Se han desarrollado distintas variantes de este péptido con el fin de mejorar su estabilidad y potenciar su actividad. Entre las modificaciones realizadas se encuentran (1) la sustitución por alanina de cada uno de sus aminoácidos para evaluar su relevancia, (2) el acortamiento del péptido para determinar la secuencia mínima que conserva la actividad deseada y (3) la creación de péptidos estructuralmente restringidos en los que se intentan mantener las características estructurales de la hélice original. A partir de las exploraciones realizadas se obtuvieron dos péptidos especialmente relevantes: TRL35, (Ac-PKIIQSVGISNLEKNLE-NH2) y TRL38 (Ac-PKIIQSVGI-NH2), de 13 y 9 aminoácidos, respectivamente.
Además, basándonos en las interacciones que se dan entre la enzima y el péptido corto deducidas de las simulaciones de dinámica molecular, se desarrolló un modelo farmacofórico que permitió la identificación de moléculas pequeñas con capacidad de inhibir la actividad enzimática.
Para finalizar, hemos caracterizado bioquímicamente la interacción entre TRL35 y TryR, logrando identificar el modelo mediante el cual se da esta inhibición y las implicaciones de esta en la estabilidad de la estructura globular de la enzima.
- English
The pharmacological treatment of Leishmaniasis still leaves much to be desired in terms of efficacy and effort devoted to the development of new agents. In the search for novel molecular entities, it is always preferable to focus on targets that are absent in the human host. Leishmania parasites lack the ubiquitous glutathione/glutathione reductase system (GSH/GluR) that is used in most prokaryotic and eukaryotic cells to detoxify their intracellular milieu from the damaging oxidizing agents produced during metabolism.
Instead, they make use of the rather unique trypanothione/trypanothione reductase (T(SH)2/TryR) system, the blockage of which can be used to impair parasite survival.
T(SH)2 is formed by two glutathione molecules bound together by a spermidine bridge. This molecule is so effective (more than glutathione) as an antioxidant that Leishmania relies solely on this system to withstand the harsh oxidant environment found inside of the phagolysosome.
TryR is a homodimeric enzyme with C2 symmetry and two independent catalytic sites, each of which is made up of residues belonging to both monomers. Therefore, the dimeric configuration of this enzyme is an absolute requirement for its activity. At the core of the interaction between TryR subunits lays the dimerization interface, a hydrophobic patch that keeps both monomers tightly joined. Right in that hydrophobic patch we have identified a couple of amino acids that are important for maintaining a proper interaction between the monomers. These amino acids, glutamic acid 492 and glutamine 495, were incorporated into a 13-mer a-helix that we designed as an inhibitory peptide targeted to the dimerization interface of TryR. To assess this peptide and its follow-up derivatives, we implemented an easy scalable activity assay and developed a new ELISA that allowed us to quantify their impact on TryR dimerization and activity.
The results obtained in this work allow us to conclude that TRL35 interacts with the Leishmania infantum TryR dimerization interface destabilizing its dimeric conformation and triggering the irreversible loss of activity because of enzyme precipitation.
- español
