Caracterización de nuevos reguladores que determinen el posicionamiento y la formación de células madre en arabidopsis thaliana

• Autores: Juan Periañez Rodríguez
• Directores de la Tesis: Miguel Ángel Moreno Risueño (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Politécnica de Madrid ( España ) en 2017
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Pilar Cubas Domínguez (presid.), Stephan Pollmann (secret.), José Manuel Vega Pérez (voc.), Óscar Lorenzo Sánchez (voc.), Juan Carlos del Pozo Benito (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biotecnología y Recursos Genéticos de Plantas y Microorganismos Asociados por la Universidad Politécnica de Madrid
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• Resumen
  • español

    Las plantas tienen la capacidad de crecer y desarrollar nuevos tejido y órganos durante toda su vida. Esta capacidad requiere de la generación y actividad de nuevas células madre. Aunque la actividad de las células madre ha sido estudiada no se conocen con exactitud los mecanismos moleculares que gobiernan la generación de nuevas células madre. El objetivo principal de esta tesis ha sido profundizar en estos mecanismos para lo cual se ha usado como modelo de estudio la raíz de la planta modelo Arabidopsis thaliana.

    Se han llevado a cabo dos aproximaciones distintas, por un lado se han identificado los genes implicados en mantener o dirigir la reprogramación celular para generar células madre pluripotentes usando una estrategia bioinformática. Esta aproximación ha identificado los genes con expresión específica o enriquecida en el periciclo, ya que es este tejido el que se reprograma para generar nuevas células madre de raíces laterales de forma endógena y también el que se puede reprogramar mediante suplementación hormonal y cultivo in vitro para formar masas celulares proliferantes o callos. Esto resulto en una lista de unos 300 genes, los cuales clasificamos por categorías funcionales, centrándonos en el análisis de factores de transcripción (27), ya que estos podrían estar implicados en mantener la expresión especifica en el periciclo y suelen ser elementos clave en las rutas de señalización. Utilizando líneas de perdida de función de estos factores se realizaron estudios que analizaron la capacidad de formación de raíces laterales y de callo para ver que genes afectaban a la pluripotencia celular. Con estos análisis identificamos dos factores reguladores de la pluripotencia durante el desarrollo postembrionario, FUF1 y OBP4.

    El estudio posterior del factor OBP4 determinó que su sobre-expresión inicia la proliferación del periciclo, presentando este más de una capa. Además la sobre-expresión de OBP4 en experimentos de formación de callo promueve la proliferación celular causando un incremento en el peso del callo que se forma. También caracterizamos su efecto sobre el mutante alf4-1, un mutante afectado en la formación del callo, observando que la sobre-expresión de OBP4 también es capaz de incrementar la formación de callo en el mutante alf4-1.

    La segunda aproximación que se ha seguido en esta tesis para identificar reguladores de la formación de nuevas células madre ha consistido en la generación de una biblioteca de mutantes con Etil metil sulfonato (EMS) y en la identificación posterior de mutantes afectados en los primeros estadios de formación de raíces laterales según los marcadores pSCARECROW:GFP y pWUSCHEL-RELATED-HOMEOBOX5:YFP. Esta búsqueda resultó en la localización de dos mutantes que afectaban a la formación de células madre en raíz, lo que ocasionaba que estos no formasen raíces laterales.

    El primer mutante resultó ser un mutante recesivo de pérdida de función que afectaba al gen GNOM y que denominamos gnom-204. Los datos que nos aporta el marcador DR5 nos indicaban falta de expresión en la zona de la raíz conocida como zona de oscilación y un exceso de marcaje en la zona de maduración, indicativa de la formación ectópica de sitios de pre-ramificación. Los sitios de pre-ramificación son el primer proceso de especificación celular asociado con la formación de células madre pluripotentes o células fundadoras de raíces laterales y dependen de la así llamada expresión periódica oscilante de genes en la zona de oscilación. Se ha descrito que la función de GNOM se relaciona con la regulación del tráfico vesicular mediado por la red trans-golgi, función que es necesaria para la actividad de los transportadores de auxinas. La mutación identificada podría permitir analizar la relación entre el tráfico de auxinas y las oscilaciones en futuros experimentos, identificando nuevas funciones de GNOM en la especificación de células madre.

    El segundo mutante que identificamos, al que nombramos como potent, afecta al gen IAA18 causando una mutación dominante, similar a otras descritas que afectan a otros IAA impidiendo su degradación por auxinas y la falta de señalización de esta hormona. Nuestros resultados muestran que esta mutación causa la activación continua de las oscilaciones en fase, que son las que determinan la especificación de sitios de pre-ramificación y de células fundadoras coincidente con su máximo de expresión. Esta sobre activación de las oscilaciones en potent genera la especificación continua de sitos de pre-ramificación y células fundadoras a lo largo de la raíz. Además, estas células fundadoras están bloqueadas en ese estadio del desarrollo. Tratamientos con la hormona auxina, que no causan reprogramación del periciclo pero que estimulan el desarrollo de células fundadoras, son capaces de conseguir que estas células pasen este bloqueo lo que da como resultado la sobre-producción de raíces laterales en el mutante.

    Uno de los factores descritos que interaccionan con IAA18 es AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF) 7 el cual resulta ser un factor oscilante en anti-fase, es decir cuya expresión esta desplazada en el tiempo un periodo con respecto a los genes en fase. Nuestros resultados indican que su mutante de perdida de función tiene las oscilaciones en fase sobre-activadas, como en el caso del mutante potent, lo que también resulta en la sobre-producción de células fundadoras. Se ha descrito que los factores IAA actúan como represores transcripcionales de los ARF. En esta tesis se ha profundizado en el mecanismo de regulación de las oscilaciones mediado por IAA18 y ARF7 aguas abajo de las auxinas. Hemos observado que la interacción entre IAA18 y potent con ARF7 es dependiente de la concentración de auxinas en el medio, favoreciendo concentraciones crecientes dicha interacción, lo cual ocurriría por interacción directa con la hormona. La dinámica de la interacción tras la aplicación de auxinas ocurre de forma similar a la activación de la expresión del gen oscilante en fase LOB-DOMAIN16, que es además una diana directa de ARF7. Nuestros datos sugieren que las auxinas actuarían de dos formas distintas, en primer lugar, a concentraciones bajas (10 nM) actuarían como inductoras de la interacción entre ambas proteínas de forma relativamente rápida durante la primera hora de exposición, para a continuación causar degradación de IAA18 a las 3 horas, lo que liberaría a ARF7 de la inhibición de IAA18. En potent además observamos que los niveles de proteína ARF7 están reprimidos mientras que los niveles de auxinas han aumentado, lo que sugiere la existencia de un bucle de retroalimentación entre el heterodimero ARF7-IAA18 y auxinas y ARF7 que podrían ser los responsables de mantener el ritmo de las oscilaciones de los genes en fase. Aunque los niveles de la interacción IAA18-ARF7 resultan ser muy bajos y dificultan su estudio si vemos aumentos periódicos que coinciden con el tiempo estimado de las oscilaciones. En segundo lugar cantidades mayores de auxinas (1M) causarían la degradación de IAA18 de forma observable en la primera hora pero la vez su activación transcripcional, de tal forma que se detecta un incremento de la activación en la primera hora, también coincidente con la activación transcripcional de LBD16. Además, la inactivación de IAA18 mediante la tecnología CRISPR-CAS9 resulta en plantas con un menor número de raíces laterales, lo que apoya el papel de IAA18 como regulador de la expresión oscilante de genes, importante para el posicionamiento de raíces laterales.

    Asimismo, el análisis microscópico de las células fundadoras que se observan en potent muestra variabilidad de tamaños, que nos indican que parecen sufrir divisiones celulares. El análisis de marcadores muestra que estas divisiones tienden a ser simétricas en tamaño y afectan a la polarización de proteínas que normalmente se observa en las divisiones de las células fundadoras. Así, la proteína MAKR4, la cual se sitúa en la membrana entre dos células fundadoras, se encontraba en el mutante situada a ambos lados de la membrana.

    Finalmente, potent presenta afectada la formación de otros tipos de raíces postembrionarias como son las raíces adventicias, mientras que el mutante arf7-1 no está afectado en este proceso, lo que nos podría estar indicando que IAA18 actúa en la formación de todo tipo de raíces pero que lo haría mediante la interacción con distintos ARF.

  • English

    ABSTRACT Plants have the capacity of grow and develop new tissues and organs during all their life. This capacity required the generation and activity of new stem cells. Although the activity of these stem cells has been studied the molecular mechanism that produce the formation of new stem cells are not well known. The main objective in this thesis has been studied these mechanism using the root of the model plant Arabidopsis thaliana.

    We have developed two different approaches, by one hand we have identified genes involved in keep and lead the cellular reprogramation to generate stem cells using a bioinformatics strategy. This approach has identified genes with specific or enriched expression in the pericycle, it is this tissue that is reprogrammed to generate new stem cells of endogenous lateral roots and also that can be reprogrammed by the hormonal supplementation and in vitro culture to form proliferating of cell masses or callus. This result in a list of about 300 genes, which we classify by functional categories, focuses on the analysis of transcription factors (27), because these could be involved in maintaining the specific expression in the pericycle and are usually key elements in the signaling. Using loss-of-function lines of these factors were performed studies that analyzed the capacity of lateral root and callus formation to see which genes affected cell pluripotency. This analysis identifies two regulatory factors of pluripotency during the post-embryonic development, FUF1 and OBP4.

    The subsequent study of the OBP4 factor determined that its overexpression initiated the proliferation of the pericycle, presenting more than one layer. In addition, overexpression of OBP4 in callus-forming experiments promotes cell proliferation causing an increase in the weight of the callus formed. We also characterize its effect on alf4-1 mutant, an affected mutant in callus formation, noting that overexpression of OBP4 is also capable of enhancing callus formation in the mutant alf4-1.

    The second approach that has been followed in this thesis to identify regulators of the formation of new stem cells has consisted in the generation of a library of mutants with Ethyl methyl sulphonate (EMS) and in the subsequent identification of affected mutants in the early stages of lateral root formation according to markers pSCARECROW:GFP and pWUSCHEL-RELATED-HOMEOBOX5:YFP. This search resulted in the localization of two mutants that affected the formation of stem cells in root, which caused that they did not form lateral roots.

    The first mutant that we identify is a recessive mutant of loss of function affecting the GNOM gene and which we call gnom-204. The data provided by the DR5 marker indicated a lack of expression in the root zone known as the oscillation zone and an excess of marking in the maturation zone indicative of ectopic formation of pre-branching sites. Pre-branching sites are the first cell specification process associated with the formation of pluripotent stem cells or lateral root founding cells and depend on the so-called oscillating periodic expression of genes in the oscillation zone. It has been described that the function of GNOM is related to the regulation of vesicular traffic mediated by the trans-golgi network, a function that is necessary for the activity of auxin transporters. The identified mutation could allow us to analyze the relationship between auxin trafficking and oscillations in future experiments, identifying new functions of GNOM in the specification of stem cells.

    The second mutant that we identify, potent, affects the IAA18 gene causing a dominant mutation, similar to others described mutants that affect other IAA by preventing its degradation induce by auxin and the lack of signaling of this hormone. Our results show that this mutation causes the continuous activation of the oscillations in phase, which are the ones that determine the specification of pre-branch sites and founder cells coincident with their maximum expression. This over-activation of oscillations in potent generates the continuous specification of pre-branch sites and founding cells along the root. In addition, these founding cells are blocked at that stage of development. Treatments with the hormone auxin, which do not cause reprogramming of the pericycle cells but which stimulate the development of founding cells, are able to get these cells to pass this blockage which results in the over-production of lateral roots in the mutant.

    One of the factors described that interact with IAA18 is AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF) 7 which is an oscillating factor in anti-phase, which means that its expression is displaced in time a period with respect to the genes in phase. Our results indicate that its loss of function mutant has over-activated phase oscillations, as in the case of potent mutant, which also results in the over-production of founder cells. AUX/IAA factors have been reported to act as transcriptional repressors of ARF. In this thesis, the knowledge of the mechanism of regulation of oscillations mediated by IAA18 and ARF7 downstream of auxins has been deepened. We observed that the interaction between IAA18 and potent with ARF7 is dependent on the concentration of auxins in the medium, which would occur through direct interaction with the hormone. The dynamics of the interaction after auxin application occurs similarly to the activation of the expression of the oscillating gene in phase LOB-DOMAIN16, which is also a direct target of ARF7. Our data suggest that auxins would act in two different ways, first, at low concentrations (10 nM) it would act as inducers of the interaction between both proteins relatively quickly during the first hour of exposure, then to cause degradation of IAA18 at 3 hours, which make free ARF7 from inhibition of IAA18. In potent we also observed that ARF7 protein levels are repressed while auxin levels have increased, suggesting the existence of a feedback loop between the heterodimer ARF7-IAA18 and auxins and ARF7 that could be responsible for maintaining the rhythm of the oscillations genes in phase. Although the levels of the IAA18-ARF7 interaction turn out to be very low and make it difficult to study we can see periodic increases that coincide with the estimated time of the oscillations. Secondly higher amounts of auxins (1M) would cause degradation of IAA18 observably in the first hour but at the same time its transcriptional activation, so that an increase of the activation in the first hour is detected, also coinciding with the activation transcription of LBD16. In addition, the inactivation of IAA18 by CRISPR-CAS9 technology results in plants with a smaller number of lateral roots, which supports the role of IAA18 as a regulator of oscillating gene expression, important for the positioning of lateral roots.

    Also, the microscopic analysis of the founder cells observed in potent shows variability of cells sizes, which indicate that it appear to undergo cell divisions. The analysis of markers shows that these divisions tend to be symmetric in size and affect the polarization of proteins normally observed in the divisions of the founder cells. Thus, the MAKR4 protein, which is located on the membrane between two founder cells, was found in the mutant located on both sides of the membrane.

    Finally, potent presents the formation of other types of post-embryonic roots such as adventitious roots, while the mutant arf7-1 is not affected in this process, which could indicate that IAA18 acts in the formation of all types of roots but would do so through interaction with distinct ARFs.