Las interacciones entre proteínas de la familia bcl2 como diana en terapia antitumoral: estudio mediante la técnica bifc y aplicación de miméticos bj3 a la leucemia linfocítica crónica
- Autores: Oscar Gonzalo Martínez
- Directores de la Tesis: Isabel Marzo Rubio (dir. tes.), José Javier Naval Iraberri (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Alberto Carrodeguas Villar (presid.), M. Mar Orzáez Calatayud (secret.), Gorka Basañez Asua (voc.)
- Materias:
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- Resumen
LAS INTERACCIONES ENTRE PROTEÍNAS DE LA FAMILIA BCL2 COMO DIANA EN TERAPIA ANTITUMORAL: ESTUDIO MEDIANTE LA TÉCNICA BiFC Y APLICACIÓN DE MIMÉTICOS BH3 A LA LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÓNICA Durante el desarrollo de este trabajo se ha podido comprobar que el empleo de la técnica de Complementación Bimolecular de Fluorescencia (BiFC) puede ser, a pesar de sus limitaciones, una buena aproximación para determinar posibles interacciones entre diferentes proteínas, y en particular en el caso que nos acontece, para las que se dan entre los miembros de la familia Bcl2. Una de las principales ventajas de esta técnica es que ofrece la capacidad de analizar uniones débiles o transitorias que de otra forma serían difíciles de detectar en el instante preciso en el que se están formando. Al mismo tiempo, el desarrollo de los ensayos en un ambiente celular completo permite analizar su localización celular así como el efecto de los mecanismos de regulación que modulan su actividad en condiciones fisiológicas.
Uno de los rasgos que no pasan desapercibidos a partir de los resultados obtenidos en este trabajo es la compleja red de interacciones ya propuesta para los integrantes de esta familia de proteínas, lo cual dificulta su interpretación y hace que en ocasiones se hayan planteado modelos controvertidos en la literatura.
La activación de Bax y Bak es uno de estos mecanismos para los que se han postulado varios modelos, de entre los cuales, la principal diferencia radica en el tipo de proteínas que el grupo de antiapoptóticas es capaz de bloquear. Así, en el modelo directo serían las proteínas “solo-BH3” activadoras las que se encuentran inhibidas por las antiapoptoticas, pudiendo interaccionar con Bax y Bak una vez liberadas de dicho bloqueo, mientras que para el modelo indirecto, la inhibición se llevaría a cabo directamente sobre estas proapoptóticas multidominio. De este modo, la interpretación del conjunto de nuestros resultados encajaría con recientes propuestas basadas en un consenso entre los anteriores, donde las proteínas antiapoptóticas bloquearían tanto a Bax y Bak en su estado activado, como a las proteínas “solo-BH3” activadoras, encargándose el grupo de “solo-BH3” sensibilizadoras de desplazar dichas uniones, favoreciendo por una parte la dimerización de estos miembros proapoptóticos multidominio, y por otra la activación de más monómeros, planteamiento en el que se basan los modelos unificado y “embedded together”.
Dentro de esta familia de proteínas, parece que todas las interacciones están determinadas básicamente por tres regiones: el dominio BH3, el bolsillo hidrofóbico canónico y el bolsillo trasero, aunque en algunos casos también se han podido identificar otras zonas alternativas de unión. De este modo, como superficies implicadas en la activación de las proteínas proapoptóticas multidominio se ha propuesto principalmente la participación de su bolsillo hidrofóbico canónico y del bolsillo trasero, donde entre Bax y Bak podrían existir diferencias en su comportamiento. Por otra parte, su comportamiento en respuesta al bloqueo de las proteínas antiapoptóticas también parece ser diferente, de modo que en el caso de Bax aparte de su dominio BH3, el cual quedaría bloqueado por el bolsillo canónico de las antiapoptóticas, también se plantea una unión alternativa en la que podrían estar implicadas su hélice α1 y la región BH4 de las antiapoptóticas. En cambio para Bak, parece que en su bloqueo por parte de las proteínas antiapoptóticas únicamente sería relevante el dominio BH3. Estas variaciones entre ambas proteínas proapoptóticas multidominio podrían deberse en parte a su distinta naturaleza ya que Bax se trata de una proteína citosólica mientras que Bak es una proteína integral de membrana. Así, poniendo ambos resultados en paralelo cabe destacar que las zonas propuestas como las implicadas en la activación de Bax y Bak por parte de las proteínas “solo-BH3”, también parecen coincidir con las superficies que las proteínas antiapoptóticas se encargarían de bloquear, lo cual recalcaría este posible diferente comportamiento entre estos miembros proapoptóticos multidominio.
Toda esta respuesta para la activación de Bax y Bak tiene como finalidad la formación de poros en la membrana mitocondrial externa a través de los cuales se liberarán el citocromo c y el resto de los factores apoptógénicos que van a desencadenar toda la cascada de eventos que culminan con la muerte de la célula. No obstante, al igual que para su activación, también existe cierta controversia en torno al mecanismo a través del cual interaccionan los monómeros de estas proteínas, habiéndose propuesto bien un modelo simétrico o asimétrico para su ensamblaje. Así, empleando nuevamente la técnica de complementación bimolecular de fluorescencia se ha intentado esclarecer dicho mecanismo de asociación partiendo de las proteínas con mutaciones en las regiones propuestas para la interacción. Sin embargo, en esta ocasión no se ha podido llegar a una conclusión inequívoca ya que dependiendo de la zona a la que afecte la mutación, así como la combinación de mutaciones estudiadas, en algunos casos los resultados parecen encajar mejor con los postulados de uno de los modelos, mientras que en otros casos la respuesta es la contraria. A pesar de esto, lo que sí parece relevante es que independientemente de cuál sea el modelo de oligomerización, el dominio BH3 tanto de Bax como de Bak es una parte determinante en el ensamblaje de los poros ya que las proteínas que lo presentan delecionado no son capaces de inducir la apoptosis al mismo nivel que las proteínas en estado “Wild-Type”.
Como se puede deducir de todos estos resultados y de los posibles mecanismos propuestos para la interacción, el equilibrio entre las proteínas que inducen la apoptosis y las que la inhiben es imprescindible para el mantenimiento de la homeostasis celular, siendo las células tumorales las que normalmente presentan alterado este balance, de manera que las uniones entre ellas quedan desreguladas favoreciendo un mayor nivel de proliferación, y siendo en este sentido el objetivo de muchos estudios el diseño de fármacos capaces de restaurar de nuevo dicho equilibrio. Debido a esto, en el trabajo aquí desarrollado se han empleado, tanto de manera individual como en combinación, “miméticos-BH3” e Ibrutinib, dos compuestos capaces de modular la función de las proteínas de la familia Bcl2 desde dos puntos de vista distintos. Para los primeros se ha podido comprobar que tanto ABT 737, como ABT 199 (recientemente aprobado por la FDA en terapia frente a LLC-B), son capaces de ejercer su efecto bloqueando la interacción entre el bolsillo canónico de las proteínas antiapoptóticas (en función de su especificidad) y el dominio BH3 de las proapoptóticas. Por su parte, Ibrutinib es capaz de modular las señales de supervivencia iniciadas desde el receptor de células B, pudiendo actuar sobre esta familia de proteínas tanto a nivel transcripcional, regulando su expresión, como a partir modificaciones postraduccionales que controlan su actividad, favoreciendo por ejemplo una forma fosforilada de los miembros antiapoptóticos, la cual, parece tener comprometida su acción protectora aunque esto último también resulta un tema de debate. Por su parte, el empleo de forma combinada ha demostrado un efecto sinérgico como tratamiento en leucemia linfocítica crónica, el cual parece deberse, al menos en parte, a su acción conjunta sobre la proteína antiapoptótica Bcl2, normalmente sobreexpresada en esta patología.
Para concluir, cabe destacar que resultaría de gran interés generar nuevos mutantes en los que se sigan modificando las regiones propuestas en las interacciones con el objetivo de comprobar su implicación en la interacción, así como su potencial para inducir la apoptosis. Del mismo modo, el siguiente paso podría ser el desarrollo de un sistema para BiFC, en el cual no fuese necesaria la transfección con los vectores portadores de las proteínas de fusión en cada ensayo, sino que las células integrasen de manera permanente estas secuencias en su genoma, siendo dicha expresión inducible a partir de un determinado estímulo. Esto permitiría el control de su expresión de manera uniforme en toda la población celular así como la reproducibilidad de los resultados, evitando variables como la eficiencia de transfección u otros factores difíciles de controlar en los ensayos transitorios. Por último, el estudio de dichas interacciones en modelos animales gracias al desarrollo de nuevas proteínas reporteras capaces de emitir una señal incluso a través de los tejidos, también supondría una mejor aproximación ya que en este caso no solo se tendría en cuenta el ambiente celular sino la totalidad del organismo.
