Estudio de las interrelaciones entre apoptosis y autofagia en células de mieloma. Efecto del inhibidor del proteasoma carfilzomib
- Autores: Vidal Jarauta Azcona
- Directores de la Tesis: Isabel Marzo Rubio (dir. tes.), José Javier Naval Iraberri (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: L. Anel (presid.), Patricia Pérez Galán (secret.), Cristina Muñoz-Pinedo (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El mieloma múltiple es un cáncer hematológico que representa el 10% de las neoplasias sanguíneas y el 1% de todos los tumores. Se caracteriza por la proliferación maligna de células B plasmáticas que se acumulan en la médula ósea. Estas células tumorales son grandes productoras de inmunoglobulinas y se ha observado que su supervivencia depende del buen funcionamiento del proteasoma, estructura macromolecular que las células necesitan para degradar proteínas mal plegadas, evitando su acumulo. Por este motivo se han desarrollado fármacos inhibidores del proteasoma para tratar de combatir esta enfermedad.
El primer inhibidor del proteasoma usado en clínica para el tratamiento de mieloma múltiple fue el bortezomib. El bortezomib es un inhibidor reversible que se une a la subunidad ß5 del proteasoma, y es un fármaco anti-mieloma muy eficaz. No obstante, se han seguido desarrollando nuevos inhibidores para tratar de vencer la resistenciaal bortezomib que muestran algunos pacientes con mieloma. Uno de estos nuevos compuestos es el carfilzomib, sobre el que se ha centrado este trabajo.
El carfilzomib, al igual que el bortezomib, inhibe la subunidad ß5 del proteasoma, pero en este caso de manera irreversible. El carfilzomib se encuentra en ensayos clínicos de Fase III, y la FDA ha permitido su uso para el tratamiento de pacientes con mieloma que hayan recibido al menos dos tratamientos previos (incluidos bortezomib y un IMiD), y que hayan mostrado una progresión de la enfermedad en un plazo de 60 días tras finalizar el último tratamiento.
1.- Estudio de la apoptosis inducida por carfilzomib.
Como se comprobó, las diferentes líneas de mieloma múltiple estudiadas, fueron sensibles en mayor o menor medida al carfilzomib. Este fármaco induce apoptosis en estas líneas, ya que tras el tratamiento, las células sufrieron condensación y fragmentación del núcleo, exposición de fosfatidilserina y caída del potencial mitocondrial.
El carfilzomib induce apoptosis a través de la vía intrínseca. La presencia de este fármaco, provoca un cambio conformacional en Bax y Bak, seguido de la liberación mitocondrial del citocromo c y la activación de la caspasa 3. En el estudio de las interacciones de las proteínas de la familia Bcl-2 mediante BiFC, se pudo observar cómo, al tratar las células con carfilzomib, disminuyeron las interacciones entre las proteínas sólo-BH3, Bim y Puma, y las antiapoptóticas Mcl-1, Bcl-2 y Bcl-xL. Esta disminución iba acompañada de un incremento en las interacciones de Bim y Puma con Bax. Noxa, aumentó su interacción con Mcl-1 y Bcl-2, así como con Bax, tras el tratamiento con carfilzomib.
La interpretación de estas interacciones es que en condiciones de viabilidad celular, las proteínas activadoras Bim y Puma permanecen unidas a las antiapoptóticas. Cuando las células son tratadas con carfilzomib, la proteína sensibilizadora Noxa se une a las antiapoptóticas Bcl-2 y Mcl-1, liberando a las activadoras Bim y Puma. Estas proteínas interaccionan principalmente con Bax, activándola y permitiendo su dimerización y formación del poro mitocondrial.
El papel de estas proteínas de la familia Bcl-2 en la apoptosis inducida por carfilzomib es crucial.Se observó que la ausencia de alguna de ellas, como Noxa, Bax o Bak, o la sobreexpresión de Bcl-xL o Mcl-1,proporciona protección frente a la muerte.
Por otro lado, el estudio de la vía extrínseca, abrió la posibilidad de que el carfilzomib indujera también apoptosis por esta vía. La inhibición de la actividad de la caspasa 3, no impedía la proteolización y activación de la caspasa 8, por lo que se pensó que esta caspasa podría activarse a través de los ligandos mortales por la ruta extrínseca.
Los análisis correspondientes permitieron comprobar que, en las líneas de mieloma estudiadas, NCI-H929, MM.1S y U266, el tratamiento con carfilzomib producía un incremento en la expresión total, y en la membrana plasmática, de los receptores mortales DR4 (en U266), DR5 (en NCI-H929 y MM.1S) y Fas (en las tres líneas), como ya se había observado en otros estudios (Han et al., 2015). Este aumento de expresión de receptores iba acompañado por el incremento de la expresión intracelular de los ligandos mortales TRAIL y FasL en las tres líneas.
Todos estos datos llevaron a pensar que el carfilzomib también podría estar induciendo apoptosis por la vía extrínseca, aunque en menor medida que por la vía intrínseca, ya que el bloqueo de los ligandos mortales, TRAIL y FasL, con el anticuerpo Rik-2 o con Fas-Fc, respectivamente, confirió una leve protección, mucho menor que la que proporcionaba la sobreexpresión de Bcl-xL o Mcl-1, o el silenciamiento de Bax, Bak o Noxa.
Otro tipo de muerte analizado fue la necroptosis, pero se comprobó que el carfilzomib no indujo este tipo de muerte celular,salvo una posible pequeña contribución en el caso de las células MM.1S.
2.- Estudio del papel de la autofagiaen el mieloma y en el tratamiento con carfilzomib.
La autofagia es inicialmente un proceso de supervivencia, que permite a la célula adaptarse a ciertas condiciones de estrés. No obstante, se discute, todavía sin llegar a un consenso, si la autofagia está implicada en la muerte celular. Nosotros hemos evaluado el posible papel que la autofagia podría jugar en el tratamiento de células de mieloma con carfilzomib.
El carfilzomib, al inhibir el proteasoma, inhibe una ruta principal de degradación de proteínas celulares. En esta situación, como las células de mieloma son grandes productoras de inmunoglobulinas, se genera estrés celular por acumulo de proteínas mal plegadas. Este efecto debería hacer, a priori, a las células de mieloma más dependientes de la autofagia para sobrevivir.
Sin embargo, hemos comprobado que el carfilzomib no induce un aumento de la autofagia, basándonos en el análisis de la expresión de las proteínas p62 y LC3B-II. No obstante, la inducción de autofagia con el inhibidor de mTOR OSI-027, previamente al tratamiento con carfilzomib, proporcionó protección en las tres líneas estudiadas, NCI-H929, MM.1S y U266. En el caso del inhibidor de mTOR PP-242, los resultados obtenidos fueron más variables, confiriendo protección frente al carfilzomib a las U266, y sensibilizando ligeramente a las MM.1S.
Estos resultados nos llevaron a concluir que la autofagia puede ser un mecanismo protector frente a la acción del carfilzomib, aunque, dependiendo de las características celulares, esto no siempre sea así, como ocurrió en el caso del inhibidor PP-242 en las células MM.1S. Esto nos dio una idea de la complejidad y posible versatilidad funcional de un proceso como la autofagia en relación con la apoptosis.
Para tratar de comprender mejor el papel de la autofagia en el tratamiento con carfilzomib, se llevó a cabo el silenciamiento de la proteína Atg5 en las líneas NCI-H929 y MM.1S. Los niveles de Atg5 se consiguieron reducir muy significativamente en ambas líneas, y en particular en las MM.1S.
El tratamiento con carfilzomib dio un resultado diferente en cada una de las líneas silenciadas. Las NCI-H929 shAtg5 se comportaron de forma similar a la línea parental, mientras que las MM.1S shAtg5 se hicieron más resistentes que las MM.1S, aunque la expresión de las proteínas participantes en la apoptosis fue similar a la de las células parentales. En cuanto a las proteínas indicadoras del flujo autofágico, p62 no desapareció y no se generó LC3B-II, como era de esperar, bien porque el carfilzomib apenas indujo autofagia, o bien porque el silenciamiento de Atg5 impidió el correcto funcionamiento de este proceso.
El papel de la autofagia en la muerte celular es controvertido. Varios estudios demuestran que la autofagia es un proceso únicamente de supervivencia, mientras que otros afirman que también puede servir como mecanismo de muerte o que, al menos, participa en ella.
En este trabajo analizamos el efecto de los inhibidores de mTOR, PP-242 y OSI-027, inductores de autofagia, en las células de mieloma con la autofagia comprometida, es decir, silenciadas para el gen de Atg5. El resultado esperable, si la autofagia fuera un mecanismo de muerte,hubiera sido que las células sin autofagia funcional (shAtg5) fueran más resistentes a estos fármacos. El resultado, en cambio, fue ambiguo. Las MM.1S shAtg5, fueron más sensibles a PP-242 y OSI-027 que las parentales, por lo que al parecer, la autofagia en estas células y en estas condiciones se comporta como un mecanismo de supervivencia. En cambio, las NCI-H929 fueron más resistentes a OSI-027 a las 24 y 48 horas. A las 72 horas y a concentraciones elevadas de OSI-027, fueron más sensibles que las NCI-H929 parentales. Sin embargo, a concentraciones menores de OSI-027, a las 72 horas, o a cualquier tiempo y concentración de PP-242, las células NCI-H929 shAtg5, fueron más resistentes que las parentales, por lo que en este caso parece que la autofagia participaría en la muerte celular.
A la vista de estos resultados observamos el complicado y ambivalente papel que puede jugar la autofagia, al menos en las células de mieloma.
3.- Análisis de la combinación de cloroquina y carfilzomib en líneas de mieloma múltiple.
La cloroquina es un inhibidor de la actividad lisosomal usado en el tratamiento contra la malaria. Al inhibir las enzimas del lisosoma, bloquea la autofagia en la últimaetapa del proceso. Por ello se probó la combinación de cloroquina y carfilzomib, es decir, la inhibición de las dos principales vías de degradación de proteínas en las células, como son la autofagia y el proteasoma. Esta combinación generaría un elevado estrés por acumulo de proteínas mal plegadas en las células de mieloma múltiple, conduciendo a la apoptosis, tal y como demostraron algunos estudios combinando hidroxicloroquina (derivado de la cloroquina) y bortezomib.
De hecho, el tratamiento combinado de cloroquina y carfilzomib en las líneas de mieloma múltiple NCI-H929, MM.1S y U266 mostró una elevada sinergia. Concentraciones bajas de ambos fármacos, que por separado apenas causaban muerte celular, combinadas inducían prácticamente un 100% de muerte. Esta muerte era debida al estrés en el retículo endoplásmico causada por el acumulo de proteínas.
Estos resultados, junto con la protección, en general, observada por la inducción de autofagia con inhibidores de mTOR previa al tratamiento con carfilzomib, nos llevaron a concluir que el carfilzomib no inducía apenas autofagia en las células de mieloma. Sin embargo, la autofagia se vuelve un mecanismo imprescindible para la supervivencia celular en condiciones de inhibición del proteasoma, ya que su bloqueo produce la muerte de casi todas las células, y su estimulación, cierta protección frente al tratamiento con carfilzomib.
En cambio, este efecto sinérgico no se observó en la combinación de la cloroquina con bortezomib, y esto podría deberse a que la inhibición reversible que provoca el bortezomib en el proteasoma permitiría, con todo, la degradación de algunas proteínas y no sería tan efectiva como la inhibición irreversible que ejerce el carfilzomib.
Debido a la gran sinergia obtenida en la combinación de cloroquina y carfilzomib, se realizaron pruebas en un co-cultivo de las células de mieloma múltiple con células del estroma (HS-5). Aunque la presencia de estas células confirió más resistencia a las células de mieloma múltiple NCI-H929 y MM.1S, como era de esperar, se siguió observando sinergia entre los dos fármacos.
Además se llevó a cabo un estudio de la combinación de estos dos fármacos in vivo. Se indujeron tumores de células NCI-H929 y se trataron con cloroquina, carfilzomib o ambas, utilizando dosis mucho menores que las usadas en los tratamientos individuales encontrados en la bibliografía. Se obtuvo algo similar a lo obtenido in vitro. Tanto la cloroquina como el carfilzomib solos retrasaban pero no inhibían el crecimiento del tumor, mientras que la combinación de ambos impidió el desarrollo e incluso redujo el volumen del tumor.
Por otro lado se observó que la combinación de cloroquina y carfilzomib causaba una posible muerte inmunogénica, basándonos en la exposición de calreticulina, lo que puede incrementar la efectividad de este tratamiento combinado, ya que haría participar al sistema inmune en la eliminación de las células tumorales e incluso generaría memoria inmunológica, previniendo posibles recaídas. No obstante, serían necesarios experimentos adicionales para confirmar estos resultados antes de una posible utilización en clínica de esta combinación.
4.- Estudio del papel de la autofagia en el crecimiento tumoral.
La autofagia juega un papel muy importante en el desarrollo tumoral. Se comporta como un mecanismo supresor de tumores en las fases iniciales de la transformación, por ejemplo, degradando mitocondrias disfuncionales que acumulan ROS que, a su vez, afectan a la estabilidad del DNA. En cambio, la autofagia es un mecanismo que facilita la supervivencia del tumor una vez que este alcanza cierto tamaño, ya que permite a las células a las que les llegan menos nutrientes u oxigeno adaptarse.
Este hecho lo pudimos comprobar in vivo con tumores generados a partir de la línea de mieloma múltiple NC-H929 y de su sublínea NCI-H929 shAtg5. El tratamiento continuado con cloroquina en ratones con tumores de NCI-H929, hizo que estos tumores alcanzaran un volumen máximo de unos 500 mm3, y que, una vez alcanzado ese tamaño, comenzaran a disminuir. Esto supone que el tumor crece hasta que por volumen se vuelve muy dependiente de la autofagia, y al inhibirla, se inhibe el crecimiento e incluso se induce la muerte de células tumorales.
Por otro lado, al inyectar y generar tumores con la línea NCI-H929 shAtg5, células que no pueden llevar a cabo una autofagia nativa, el tamaño de éstos no sobrepasó los 150 mm3. De esta manera se comprobó que si las células tienen la autofagia comprometida, pueden formar tumor, pero el crecimiento de éste llega a un límite, impidiendo mayor desarrollo tumoral, debido a la imposibilidad de adaptación de las células a las que llegan menos nutrientes o factores necesarios.
