Análisis funcional de rex1 y yingyang2 en el periodo peri-implantacional del embrión de ratón
- Autores: Amaia Berraondo Ibarguren
- Directores de la Tesis: Johan Albert Schoorlemmer (dir. tes.), Pedro Muniesa Lorda (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jesús Ruberte París (presid.), María Climent Aroz (secret.), José Terrado Vicente (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas y Biotecnológicas por la Universidad de La Rioja y la Universidad de Zaragoza
- Materias:
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- Resumen
Reduced expression-1 (Rex1/Zfp42) y Yin Yang2 (Yy2) son factores de transcripción presentes únicamente en mamíferos placentarios, originados por retrotransposición de Yin Yang1 (Yy1), gen presente y altamente conservado en los metazoos (Kim et al., 2007). Los tres conservan una gran homología en el dominio de sus cuatro "dedos de zinc" de tipo Cis2-His2, que comparten. Mientras que YY1 es un factor ubicuo, con posibilidad de actuar como activador o represor en función del contexto genómico y celular (Donohoe et al., 1999). Rex1 constituye uno de los principales marcadores de pluripotencia en células troncales embrionarias. La información disponible sobre Yy2 es aún más escasa y fragmentaria. En trabajos anteriores del grupo han mostrado que Rex1 y Yy2 se expresan durante el desarrollo preimplantacional, están presentes en las líneas celulares embrionarias (ES y TS), obtenidas en la fase de blastocisto, y contribuyen al mantenimiento de la pluripotencia y proliferación in vitro de líneas celulares ES. También están presentes en células trofoblásticas gigantes en los márgenes del disco placentario, así como (YY2 en particular) en células germinales del testículo y en líneas celulares troncales espermatogoniales (SSC) (Guallar et al., 2012; Climent et al. 2013; Perez-Palacios et al., en preparación).
El análisis ya realizado mediante ChIPseq de la asociación a cromatina de Rex1 en células ES (Guallar et al., en preparación), así como el de Yy2 en células TS y SSCs (en curso de realización), han puesto de manifiesto su unión respectiva a un conjunto de dianas génicas, con representación significativa de ciertos elementos retrovirales endógenos (Schoorlemmer et al., 2014; Guallar et al., 2012; García-Tuñón et al., 2011). Hemos realizado un análisis del desarrollo preimplantacional, mediante estudios de aumento y disminución de la expresión de Rex1 y Yy2 sin encontrar efectos fenotípicos significativos, exceptuando un déficit de desarrollo embrionario hasta el estadio de blastocisto en la sobreexpresión de Rex1. Sin embargo se ha evidenciado la alteración de expresión en varios de los genes diana, tanto de REX1, como de YY2. Varias de estas dianas podrían desempeñar un importante papel en la transición del estadio de blastocisto libre al de blastocisto implantado, participando por un lado en el establecimiento y mantenimiento del estado de pluripotencia necesario para el desarrollo de los tejidos y órganos embrionarios como su participación en el proceso de activación o inactivación del cromosoma X (Navarro et al., 2010), al tiempo que permite la diferenciación activa y funcional del trofoectodermo que posibilita la implantación. La gestión de marcas epigenéticas en la línea germinal masculina de otro, parece tener especial relevancia en el control de la expresión génica durante la evolución de la placenta de los mamíferos, puesta de manifiesto en los casos conocidos de impronta genética.
La expresión de los factores de transcripción REX1 y YY2, y de sus dianas génicas (Guallar et al., en preparación), nos permiten plantear la hipótesis de trabajo siguiente: durante el periodo peri-implantacional podrían manifestarse algunos de los aspectos funcionales clave para entender el papel real que estos factores desempeñan. Dicho papel podría evidenciarse en cambios significativos en la expresión de Rex1 y Yy2 o de sus dianas, los cuales podrían afectar a procesos fundamentales que tienen lugar en el momento de la implantación y del inicio del desarrollo placentario. Incluso podrían actuar en el control del proceso de diapausa y mantenimiento de la potencia de desarrollo embrionario durante el periodo de reposo. El fenómeno de diapausa parece ser mucho más común de lo que se suponía hasta ahora en los embriones de mamíferos y pudo representar un paso obligado facilitador del desarrollo de la placentación al flexibilizar la duración y coincidencia de la ventana temporal que define el periodo de interacción eficaz entre los tejidos embrionarios y maternos.
En primer lugar hemos derivado y caracterizado líneas ES de ambos sexos (XX y XY) en un trasfondo genético homogéneo, con el fin de disponer de una herramienta celular en la que poder analizar las funciones de Rex1 y Yy2 en la gestión de la cromatina en relación a la activación o inactivación del cromosoma X y el mantenimiento de la pluripotencia. En presencia del combinado 2i de inhibidores de kinasas GSK3 (CHIR 99021) y ERK1/2 (PD032591), fue posible obtener líneas celulares ES de la estirpe transgénica no permisiva CYP3A4-luc, de fondo genético consanguíneo FVB/N. Se derivaron 14 líneas ES, denominadas FCL, con una eficacia en torno al 60%, de las cuales el 65% (9 líneas: 5 XX y 4 XY), tuvieron un cariotipo normal. Como parte de la caracterización de las células ES derivadas, la línea FCL3.3 ensayada, mantiene la pluripotencia en condiciones de cultivo tanto en ausencia de 2i, como en ausencia de la capa nutricia de fibroblastos embrionarios, sin observarse variaciones significativas en la expresión de REX1. Las líneas FCL2.2 y FCL3.3 manifiestan pluripotencia in vivo al ser capaces de formar teratomas, presentando focos de diferenciación con derivados de las tres hojas embrionarias: ectodermo, mesodermo y endodermo. La diferenciación in vitro por la formación de cuerpos embrioides también ha producido múltiples derivados diferenciados, incluyendo focos de expresión del marcador hepático bioluminiscente CYP3A4-Luc. Este hecho nos permite confiar en que las líneas celulares FCL, de ámbos sexos y en fondo genético homogéneo, pueden constituir una herramienta fundamental para el análisis del papel funcional de REX1 y YY2.
Posteriormente, y dada la ausencia de datos sobre la expresión y función de las proteínas REX1 y YY2 en estadios y procesos relacionados con la implantación, nuestro objetivo ha sido caracterizar la expresión de REX1 y YY2 y determinar su función en el desarrollo embrionario perimplantacional: en la eclosión, adhesión y expansión de los blastocistos de ratón in vitro. Para ello se han cultivado in vitro hasta su eclosión y adhesión blastocistos de ratón. Hemos observado que REX1 y YY2 están presentes en el trofoblasto de blastocistos eclosionados y adheridos in vitro. REX1 está tanto en células gigantes mononucleadas como multinucleadas, presentando una localización fundamentalmente nuclear. Este hecho confirma y amplia la información relativa a la presencia tanto REX1 como de YY2 durante el proceso de formación y diferenciación de las células trofoblásticas gigantes parietales (P-TGCs). En las P-TGCs secundarias, la presencia de YY2 es menos evidente. Respecto a embriones a los que se ha modificado la expresión de Rex1 y/o Yy2, ni la sobreexpresión de Rex1, ni la disminución de Yy2 tiene un efecto notable en el desarrollo y eclosión de blastocistos cultivados in vitro. La disminución de Rex1 provoca un moderado descenso en la eclosión in vitro de los blastocistos cultivados.
En contraposición a Rex1 y su expresión limitada al estado de pluripotencia, se ha supuesto que Yy2 podría tener una expresión más generalizada. De ahí, el interés de analizar la capacidad de diferenciación in vitro, mediante la producción y cultivo de cuerpos embrioides a partir de células ES con niveles reducidos de Yy2. La depleción temporal de Yy2 en las células ES de la línea E14T, no afectó a la morfología aparente de los cuerpos embrioides que se forman a partir de ellas, aunque provocó una ligera disminución en el número de cuerpos embrioides formados.
Por último, dado que la diapausa se trata de una estrategia reproductiva de gran importancia, caracterizar la expresión de REX1 y YY2 en embriones en diapausa de ratón y determinar si Rex1 y/o Yy2 pueden tener algún papel activo en su regulación. Se indujo la diapausa y se analizó los embriones llegando a la conclusión de que en embriones en diapausa, REX1 y YY2 están presentes en los núcleos de las células del trofoblasto. YY2 tiene una clara presencia nuclear tanto en las células epiblásticas, como en las células del endodermo primitivo, mientras que REX1 parece tener una distribución más difusa y citoplasmática en este estado de reposo embrionario. CD9, a cuyo gen se ha visto asociación de REX1 en experimentos previos de inmunoprecipitación de cromatina y secuenciación masiva (ChIPseq), presenta en el blastocisto en diapausa una sugerente distribución con clara presencia en el dominio basolateral y ausencia en el dominio apical de las células del trofoblasto.
Los resultados de este trabajo apoyan la hipótesis de que durante el periodo peri-implantacional Rex1 y Yy2 pueden tener un papel clave para la implantación y conservación de la potencialidad durante la diapausa.
