Inmunosensores amperométricos y espectrofotométricos para la determinación de micotoxinas en alimentos y drogas de abuso en muestras biológicas
- Autores: Juan R. Bertolín
- Directores de la Tesis: Juan Ramón Castillo Suárez (dir. tes.), Juan C. Vidal Ibánez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Marcel Blanco Romia (presid.), Maria Sierra Jiménez García Alcalá (secret.), Maria Encarnacion Lorenzo Abad (voc.)
- Materias:
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- Resumen
INTRODUCCIÓN O MOTIVACIÓN DE LA TESIS:
EL ASEGURAMIENTO EN LA INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS SE HA CONSTITUIDO EN LOS ÚLTIMOS AÑOS COMO UNA META IMPORTANTE A NIVEL INTERNACIONAL. ENTRE LOS PELIGROS QUÍMICOS, LA ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD (OMS) HA CARACTERIZADO RECIENTEMENTE LA CONTAMINACIÓN DE LOS ALIMENTOS CON MICOTOXINAS.
ESTAS MICOTOXINAS (AFLATOXINAS, FUMONISINAS, DEOXINIVALENOL, OCRATOXINAS...) SON METABOLITOS SECUNDARIOS TÓXICOS DE HONGOS COMO EL ASPERGILLUS, EL PENICILLIUM O EL FUSARIUM ENTRE OTROS [1].
EL CONSUMO CONTINUADO DE ALIMENTOS CONTAMINADOS CON ESTAS MICOTOXINAS PUEDE PROVOCAR DIVERSAS ENFERMEDADES [2]. POR ESTE MOTIVO, CADA VEZ MÁS PAÍSES ESTÁN DESARROLLANDO REGLAMENTACIONES MÁS ESTRICTAS, ESTABLECIENDO LÍMITES MÁXIMOS DE MICOTOXINAS EN DIVERSOS ALIMENTOS, COMO EL REGLAMENTO CE Nº 1881/2006 DE LA COMISIÓN DE 19 DE DICIEMBRE DE 2006 [3-4].
LA FUMONISINA B1 (FB1) ES UNA SUSTANCIA HEPATOTÓXICA Y NEFROTÓXICA PRODUCIDA POR VARIAS ESPECIES DEL HONGO FUSARIUM. ÉSTA PUEDE ESTAR PRESENTE EN DISTINTOS ALIMENTOS, ENTRE LOS QUE SE DESTACA EL MAÍZ, MATRIZ EN LA QUE LA LEGISLACIÓN EUROPEA MARCA UNOS LÍMITES MÁXIMOS ENTRE 200 Y 2000 NG/G DE FB1 [3].
EL DEOXINIVALENOL (DON) ES UNA MICOTOXINA PRODUCIDA POR VARIOS HONGOS PATÓGENOS DEL GÉNERO FUSARIUM. PUEDE ESTAR PRESENTE EN DISTINTOS ALIMENTOS, PRINCIPALMENTE CEREALES, ENTRE LOS QUE SE DESTACAN EL TRIGO Y EL MAÍZ. AUNQUE SU TOXICIDAD ES BAJA COMPARADA CON LA DE LAS AFLATOXINAS Y LA OCRATOXINA A, ÉSTE PUEDE PRESENTAR EFECTOS TERATOGÉNICOS E INMUNOTÓXICOS, POR ELLO, LA LEGISLACIÓN EUROPEA MARCA LÍMITES MÁXIMOS QUE OSCILAN ENTRE 200 Y 1750 NG/G DE DON [3].
LA OCRATOXINA A (OTA) ES UNA SUSTANCIA PRODUCIDA POR LOS HONGOS ASPERGILLUS Y PENICILLIUM, ESTÁ CLASIFICADA COMO UNA SUSTANCIA 2B, POSIBLEMENTE CARCINOGÉNICA, ADEMÁS PRESENTA EFECTOS NEFROTÓXICOS E INMONUTÓXICOS Y SEGÚN LA AGENCIA EUROPEA DE SEGURIDAD ALIMENTARIA (EFSA) SE ESTABLECEN UNOS LÍMITES DE INGESTA SEMANAL TOLERABLE DE 120 NG KG-1 PC [5]. LA OCRATOXINA A ESTÁ PRESENTE EN DISTINTOS ALIMENTOS COMO SON CEREALES (MAÍZ Y TRIGO PRINCIPALMENTE), CAFÉ, UVAS PASAS, VINO, ETC Y LOS LÍMITES MÁXIMOS PERMITIDOS POR LA LEGISLACIÓN EUROPEA PARA ESTE TIPO DE PRODUCTOS OSCILAN ENTRE LOS 0,5 Y LOS 5 NG/G [3] A EXCEPCIÓN DE LAS ESPECIAS (CHILE, PIMIENTA, NUEZ MOSCADA...) Y EL REGALIZ, CUYOS LÍMITES MÁXIMOS OSCILAN ENTRE LOS 15 Y LOS 80 NG/G [4].
LAS DROGAS DE ABUSO SON UN GRUPO DE SUSTANCIAS PSICOACTIVAS O PSICOTRÓPICAS, CAPACES DE ESTIMULAR O DEPRIMIR EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL, MODIFICAR LA PERCEPCIÓN, ETC. LA COCAÍNA POR SU PARTE ES UN POTENTE ESTIMULANTE DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL QUE INCREMENTA LA ATENCIÓN Y EL ESTADO DE EUFORIA, TAMBIÉN ES UTILIZADO COMO ANESTÉSICO Y ES UN POTENTE INHIBIDOR DE CATECOLAMINAS LO QUE SE TRADUCE EN LA ACUMULACIÓN DE DOPAMINA Y SEROTONINA EN EL ORGANISMO [6].
EL CONSUMO CONTINUADO DE ESTA SUSTANCIA PUEDE PRODUCIR ALTERACIONES AFECTIVAS, CAMBIOS EN LA SOCIABILIDAD, HIPERVIGILANCIA, SENSIBILIDAD INTERPERSONAL, ANSIEDAD, TENSIÓN O MIEDO; MIENTRAS QUE UNA INTOXICACIÓN AGUDA POR COCAÍNA PUEDE PROVOCAR TAQUICARDIA O BRADICARDIA, DEBILIDAD MUSCULAR, DEPRESIÓN RESPIRATORIA, DOLOR TORÁCICO, ARRITMIAS CARDÍACAS, ETC [7].
EL CONTROL DEL CONSUMO DE COCAÍNA TIENE INTERÉS EN LA REHABILITACIÓN DE PERSONAS ADICTAS, EN AUTOPSIAS (SOBREDOSIS), PROCESOS JUDICIALES (TRÁFICO, PROCESOS PENALES), ESTUDIOS EPIDEMIOLÓGICOS Y ASUNTOS DEPORTIVOS ENTRE OTROS. LA GRAN MAYORÍA DE TEST COMERCIALES ASÍ COMO METODOLOGÍA OFICIAL DE ANÁLISIS SE BASAN EN LA DETERMINACIÓN DEL METABOLITO MAYORITARIO DE LA COCAÍNA UNA VEZ INGERIDA, QUE ES LA BENZOILECGONINA (BZE), YA QUE LA COCAÍNA ES RÁPIDAMENTE METABOLIZADA [8] (TIEMPO DE VIDA MEDIO DE 0,5 A 1,5 HORAS) A DICHO METABOLITO, EL CUAL NO POSEE ACTIVIDAD. DE ESTA MANERA, LA DETERMINACIÓN DE COCAÍNA, Y NO DE SU METABOLITO, NOS PROPORCIONA INFORMACIÓN ACERCA DE QUE EL CONSUMO DE LA MISMA HA SIDO RECIENTE Y EL INDIVIDUO ESTÁ BAJO LOS EFECTOS DE DICHA SUSTANCIA EN EL MOMENTO DE LA TOMA DE MUESTRA, ALGO QUE MEDIANTE EL ANÁLISIS DE SU METABOLITO (BZE) NO PUEDE CONCLUIRSE, YA QUE ESTE PERMANECE EN EL ORGANISMO INCLUSO HASTA 36 HORAS DESPUÉS DEL CONSUMO DE COCAÍNA [7].
DESARROLLO TEÓRICO:
EN ESTE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN SE HA DESARROLLADO UN INMUNOENSAYO PARA LA DETERMINACIÓN DE OCRATOXINA A (OTA) EN ALIMENTOS, PRINCIPALMENTE EN CEREALES (TRIGO Y MAÍZ) Y EN VINO, DENTRO DE UN OBJETIVO MÁS AMBICIOSO QUE ES EL DE LA DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA DE FB1, DON Y OTA EN DICHAS MATRICES; Y OTRO INMUNOENSAYO PARA LA DETERMINACIÓN DE COCAÍNA EN DISTINTAS MATRICES BIOLÓGICAS (SALIVA, ORINA Y SUERO HUMANO), AMBOS CON TRANSDUCCIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA Y AMPEROMÉTRICA DE LA SEÑAL Y CON UNA METODOLOGÍA DE TRABAJO RÁPIDA, SENCILLA Y ECONÓMICA PARA QUE PUEDA SER UTILIZADA POR PERSONAL NO ESPECIALIZADO EN DISTINTOS CONTROLES ANALÍTICOS.
EN EL CASO DE AMBOS INMUNOSENSAYOS, TANTO PARA LA OCRATOXINA A COMO PARA LA COCAÍNA:
- ELECCIÓN DEL ANTICUERPO ASÍ COMO DE LA SUPERFICIE DE BIORECONOCIMIENTO DEL MISMO (MICROPARTÍCULAS MAGNÉTICAS): BASÁNDOSE EN LOS ESTUDIOS ANTERIORES REALIZADOS POR EL GRUPO, SE REALIZARON DISTINTAS PRUEBAS CON APTÁMEROS Y ANTICUERPOS DE DISTINTAS CASAS COMERCIALES (QUE SE COMPROMETIERON A PROPORCIONAR UN SUMINISTRO CONTINUADO) SOBRE DISTINTAS MICROPARTÍCULAS MAGNÉTICAS (MBS) COMERCIALES QUE ACTUARÁN COMO SOPORTE DE BIORECONOCIMIENTO DEL MISMO. SE ESTUDIÓ LA AFINIDAD, SENSIBILIDAD Y SELECTIVIDAD DE CADA UNO DE ELLOS SOBRE CADA TIPO DE MBS.
-OPTIMIZACIÓN DE DISTINTAS VARIABLES DE AMBOS INMUNOSENSORES MEDIANTE ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) ESPECTROFOTOMÉTRICO: SE OPTIMIZARON DISTINTOS PARÁMETROS DEL INMUNOENSAYO ENTRE LOS QUE SE DESTACAN: TIEMPO Y TEMPERATURA DE INMOVILIZACIÓN DEL ANTICUERPO, CANTIDAD DE ANTICUERPO POR CANTIDAD DE MBS, CONCENTRACIÓN DE CONJUGADO, CANTIDAD DE MBS EN EL ENSAYO, TIEMPO Y TEMPERATURA DE COMPETICIÓN, ETC.
- ELECCIÓN DE LA SUPERFICIE DE TRANSDUCCIÓN ELECTROQUÍMICA DE LA SEÑAL, INSTRUMENTACIÓN, TÉCNICA ELECTROQUÍMICA Y SUSTRATOS ENZIMÁTICOS: SE PROCEDIÓ A LA COMPARATIVA DE DISTINTAS SUPERFICIES PARA EL PROCESO DE TRANSDUCCIÓN ELECTROQUÍMICA DE LA SEÑAL, ES DECIR, A LA COMPARATIVA DE DISTINTOS ELECTRODOS SERIGRAFIADOS DE CARBONO (SPCES), DE DISTINTOS POTENCIOSTATOS Y DE DISTINTAS TÉCNICAS DE MEDIDA (DETECCIÓN AMPEROMÉTRICA, DPV, ETC), ATENDIENDO TANTO A CRITERIOS ANALÍTICOS (SENSIBILIDAD, LÍMITES DE DETECCIÓN, EXACTITUD, PRECISIÓN, ETC) ASÍ COMO OTROS MENOS ANALÍTICOS COMO SON LA RAPIDEZ, LA SENCILLEZ Y COSTE.
EN AMBOS CASOS, SE RECOPILÓ TODA LA METODOLOGÍA OPTIMIZADA DE UNA FORMA VERAZ Y CONCISA DANDO LUGAR A INMUNOENSAYOS QUE PUEDAN SER UTILIZADOS POR PERSONAL NO CUALIFICADO CON EL OBJETIVO FINAL DE DARLE SALIDA COMERCIAL.
-VALIDACIÓN DE DICHOS INMUNOSENSORES ESPECTROFOTOMÉTRICOS Y ELECTROQUÍMICOS: PARA LA VALIDACIÓN DE AMBOS INMUNOSENSORES SE RECURRIÓ A LA COMPARATIVA CON METODOLOGÍA OFICIAL DE ANÁLISIS (AOAC), EL USO DE MATERIALES DE REFERENCIA CERTIFICADOS Y ESTUDIOS DE RECUPERACIÓN.
EN EL CASO DEL INMUNOENSAYO DE OCRATOXINA A:
-DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA DE LAS TRES MICOTOXINAS (FB1, DON Y OTA): ESTE PROCESO DE OPTIMIZACIÓN DEL INMUNOSENSOR DE OTA, SE ENGLOBÓ DENTRO DE UN OBJETIVO FINAL DE PROPORCIONAR, EN LA MEDIDA DE LO POSIBLE, UN INMUNOENSAYO O PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL QUE PERMITIERA LA DETERMINACIÓN CONJUNTA DE LAS TRES MICOTOXINAS DESARROLLANDO UNA METODOLOGÍA LO MÁS SENCILLA Y RÁPIDA POSIBLE.
CON RESPECTO A LA METODOLOGÍA A UTILIZAR A LO LARGO DE TODO ESTE TRABAJO, DESTACA EL USO DE DISTINTOS TIPOS DE TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS (DPV, DETECCIÓN AMPEROMÉTRICA, VOLTAMETRÍA CÍCLICA, ETC), TÉCNICAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS Y DE INMUNOANÁLISIS (ELISA) Y METODOLOGÍAS OFICIALES DE ANÁLISIS DE MICOTOXINAS (HPLC CON DETECTOR DE UV-VISIBLE Y DETECTOR DE FLUORESCENCIA) [9].
CONCLUSIÓN:
POR TODO LO EXPUESTO ANTERIORMENTE, ES DE VITAL IMPORTANCIA ESTE TIPO DE ESTUDIOS DE INVESTIGACIÓN CON EL OBJETIVO DE DESARROLLAR Y PODER DISPONER DE TÉCNICAS ROBUSTAS, REPRODUCIBLES, Y A SER POSIBLE RÁPIDAS, ECONÓMICAS Y DE METODOLOGÍA SENCILLA PARA LA CUANTIFICACIÓN DE ESTAS MICOTOXINAS EN LOS DISTINTOS ALIMENTOS Y DE COCAÍNA EN MUESTRAS BIOLÓGICAS.
BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA:
[1] MYCOTOXINS: DETECTION METHODS, MANAGEMENT, PUBLIC HEALTH AND AGRICULTURAL TRADE. JOHN F. LESLIE, RANAJIT BANDYOPADHYAY, ANGELO VISCONTI. CAB INTERNATIONAL 2008.
[2] PFOHL-LESZKOWICZ, A., MANDERVILLE, R.A. 2007. OCHRATOXIN A: AN OVERVIEW ON TOXICITY AND CARCINOGENICITY IN ANIMALS AND HUMANS. MOL NUT FOOD RES. 5:61-99.
[3] REGLAMENTO CE Nº 1881/2006 DE LA COMISIÓN DE 19 DE DICIEMBRE DE 2006, POR EL QUE SE FIJA EL CONTENIDO MÁXIMO DE DETERMINADOS CONTAMINANTES EN LOS PRODUCTOSALIMENTICIOS.
[4] REGLAMENTO CE Nº 105/2010 DE LA 5 DE FEBRERO DE 2010 QUE MODIFICA EL REGLAMENTO (CE) N O 1881/2006, POR EL QUE SE FIJA EL CONTENIDO MÁXIMO DE DETERMINADOS CONTAMINANTES EN LOS PRODUCTOS ALIMENTICIOS POR LO QUE SE REFIERE A LA OCRATOXINA A.
[5] EFSA. OPINION OF THE SCIENTIFIC PANEL ON CONTAMINANTS IN THE FOOD CHAIN [CONTAM] RELATED TO OCHRATOXIN A IN FOOD. 2006; DOI:10.2903/J.EFSA.2006.365.
[6] BORTOLOTTI, F.; GOTTARDO, R.; PASCALI, J.; TAGLIARO, F., TOXICOKINETICS OF COCAINE AND METABOLITES: THE FORENSIC TOXICOLOGICAL APPROACH, CURR. MED. CHEM. 2012, 19, 5658-5663.
[7] COCAÍNA: ASPECTOS FARMACOLÓGICOS. LIZASOAIN, I.; MORO, M.A.; LORENZO, P. DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA. FACULTAD DE MEDICINA. UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID.
[8] PENNINGS, EJM; LECCESE, AP; DE WOLFF, FA, EFFECTS OF CONCURRENT USE OF ALCOHOL AND COCAINE ADDICTION. 2002, 97, 773-783 [9] HTTP://VICAM.COM/HOME
