Resumen de Mimicking cell surfaces and cell environments: patterning combined gradients of multiple biomolecular species
1-Resumen capítulo 1 Y 2: Introducción y objestivos:
La membrana celular es un es una estructura semi-permeable que engloba el citoplasma celular. Ha sido estudiada desde tiempo atrás cuando se predijo el modelo de mosaico fluido. La membrana celular no es un sistema homogéneo debido a que alberga en su estructura multitud de moléculas con una distribución definida que proporcion a la célula posibilidad de comunicación y relación con otras células y el medio extracelular que le rodea. En estos procesos de comunicación y relación es donde mostramos interés y más específicamente en la adhesión celular. La adhesión celular es un proceso de gran interés debido principalmente que es el fundamento por el cual las células en un organismo forman un tejido u órgano. La adhesión celular no es solo un proceso de ensamblaje de células ya que es conocido que las moléculas que intervienen en procesos de adhesión forman también parte de vías de señalización que regular procesos como expresión de genes, apoptosis, migración. No solo la adhesión celular es importante en organismos vivos ya que la adhesión de células a materiales sintéticos es un aspecto a considerar para el desarrollo de material quirúrgico , tejidos artificiales y biosensores entre otros aspectos. Existen principalmente cinco familias de moléculas de adhesión: Superfamilia de Inmunoglobulinas, Caderinas, Integrinas, Selectinas y Proteoglicanos. Mostramos en nuestro caso interés por tres moléculas dentro de estas familias: Manosa como carbohidrato presente en la superficie celular formando parte de glicoproteínas, péptido RGD, péptido presente en la fibronectina, vitronectina y trombospodina de la matriz extracelular y E-Caderina, glicoproteína presente en la superficie de algunos tipos celulares.
Nos centramos durante el desarrollo de esta tesis doctoral en el empleo de avanzados métodos de micro y nanofabricación para controlar a escala micro y manométrica la composición y la estructura de estas moléculas para así intentar comprender como los procesos de adhesión celular se ven afectados por esta distribución además de comparar entre si la predilección celular por uno u otro tipo de moléculas. La ingeniería de superficies nos ofrece variedad de herramientas para la biometización de estas biomoléculas en soportes inertes para poder llevar a cabo el estudio de interacción células-biomoléculas. El ¿perfecto¿ biomaterial debería ser fácil de preparar y caracterizar, versátil, fácil de funcionalizar, biocompatible y eficiente. Por eso en el desarrollo de este trabajo nos decantamos por el uso de vidrio como elemento base para la modificación físico-química y posterior estudio celular. , Muchas estrategias han sido empleadas en la modificación química de materiales ya sea mediante modificación covalente o no covalente, ambas presentan sus ventajas y sus desventajas.
La modificación covalente de estructuras nos asegura una fuerte interacción biomolécula-superficie aunque para esto la superficie ha de ser previamente modificada lo cual podría alterar en ciertos casos la topografía de la superficie y tampoco podríamos garantizar una correcta orientación de la molécula de interés. Una modificación no covalente tampoco nos asegura una correcta orientación ya que esta dependería mucho de las condiciones en las que la modificación se llevase a cabo. Desarrollamos metodología para una unión covalente debido a que nos asegura un enlace fuerte y más estable durante el tiempo.
El control temporal y espacial de la funcionalidad superficial para el estudio de la diferente adhesión sobre las múltiples funcionalidades a introducir ha sido desarrollado durante tiempo en numerosas líneas de investigación, los más destacados sistemas para llevar a cabo esta compartimentalización ha sido la creación de patterns definidos o gradientes de concentración.
Las técnicas que permiten llevar a cabo este tipo de distribución controlada de biomoleculas son variadas: ink-jet printing and dip pen nanolithography son técnicas secuenciales que permiten crear micro o nanoarrays de variedad de especies. El printing por contacto y la fotolitografía óptica son técnicas en paralelo que además nos permiten mayor control y versatilidad en la forma y tamaño del pattern aunque presenta limitaciones en cuanto a resolución pero ventajas en cuanto a definición del pattern.
Las técnicas de Ink-jet printing y dip pen nanolithography tienen el mismo fundamento, ambas se basan en la impresión directa de puntos de diferente tamaño, en función del volumen de muestra seleccionado, sobre la superficie. En el caso de el printing por contacto se ha de fabricar un molde mediante empleo de litografía óptica convencional o mediante litografía electrónica que será cubierto de un polímero (polidimetilsiloxano, PDMS) que no servirá de ¿sello¿ donde está la estructura de interés a imprimir.
La fotolitografía óptica se basa en el empleo de una resina fotosensible que cubre la superficie de interés, esta superficie es expuesta a la luz UV a través de una máscara con zonas trasparentes y opacas (pattern a transferir). Las zonas en contacto con la luz UV se ven afectadas y son retiradas mediante un post tratamiento o no dependiendo del tipo de resina utilizado (positiva, las zona irradiadas son sensibles a tratamiento posterior y negativa, donde las zonas irradiadas son estables al tratamiento posterior) quedando el pattern sobre la superficie.
A parte de estas técnicas la microfluídica puede también ser empleada para la creación de patterns químicos sobre superficies . En microfluídica los microcanales son usados para la entrada de fluidos y llegada de estos a zonas controladas donde se llevara a cabo contacto entre el fluido (mezcla de reactivos a transferir) y la superficie a modificar quedando el pattern sobre la misma. Esta técnica tiene gran interés debido principalmente a la limitación en reactivos y tamaño del pattern transferido, tiene también sus limitaciones que son básicamente operacionales.
2-Resumen capítulo 3:Biofuncionalización de materiales inorgánicos con fragmentos de Caderinas.
El capítulo tercero de esta tesis doctoral tiene como fin el desarrollo de un método de funcionalización de superficies de vidrio con proteínas previamente modificadas para que presentaran en su extremo final un fragmento de histidinas. La principal novedad en el método que fue desarrollado durante este capítulo es la unión covalente de las mismas asegurando además de la correcta orientación una alta estabilidad de las proteínas usadas. Se emplearon proteínas de adhesión celular como es la Caderinas, estas proteínas fueron unidas a los soportes de vidrio con el fin de que presentaran la misma orientación y actividad que en la membrana de las células para poder ser empleados estos biomateriales como soportes para el estudio de mecanismos de adhesión celular. La funcionalización de estas estructuras siguió un proceso de caracterización en cada una de las etapas y fueron empleadas técnicas como microscopia confocal, XPS (espectroscopia de fotoelectrones emitidos por rayos X), ángulo de contacto y AFM (microscopia de fuerzas atómicas). Estas técnicas permitieron conocer que las superficies preparadas presentaban una alta densidad de recubrimiento, alta estabilidad de unión y una alta tendencia de estas a la adhesión y crecimiento celular. En la figura 1 que se muestra a continuación se expone un resumen de la metodología desarrollada. En la primer parte de la figura se explica cómo fue llevado a cabo el proceso de unión covalente de la proteína primero mediante unión no covalente a través de ion Ni 2+ y tras esto una unión covalente usando EDC y NHS. En la segunda de las partes se muestran los resultados obtenidos por AFM y XPS antes y después de la unión observándose una alta funcionalización de la proteína estable. Finalmente se llevo a cabo la adhesión de células específicas que mostraban caderinas observándose como se producía una adhesión total de las mismas mediante unión caderina-caderina.
3-Resumen capítulo 4: Litografía óptica.
En el capítulo cuarto de este trabajo se ha llevado a cabo el empleo de la fotolitografía para el desarrollo de un método robusto para el control en la distribución de diferentes moléculas sobre soportes de vidrio. Se emplearon carbohidratos (Manosa ) y péptidos (RGD) con importancia en procesos de adesión celular como moléculas para anclaje celular y polietilenglicol para evitar adsorciones inespecíficas en zonas no deseadas. La fotolitografía fue empleada como método para la creación de patrones (en nuestro caso líneas) que pueden ser simples o de mas elaboración. El proceso de funcionalización y modificación fue seguido mediante empleo de ángulo de contacto, XPS (espectroscopia de fotoelectrones emitidos por rayos X), microscopia de fluorescencia y ensayos de viabilidad celular. En la figura 2 mostrada a continuación se describe la metodología empleada y los resultados obtenidos en este capítulo. En la primera de las partes se presentan todos los grupos funcionales empleados para la creación de estas estructuras tanto para la parte activa (amino, epoxido, azida, Manosa y RGD) como para la parte no activa (PEG). En la parte dos de la figura se esquematizan los pasos seguidos durante el desarrollo de la preparación de cada una de las muestras mediante el empleo de la litografía óptica. En el último de los apartados se muestra la caracterización completa de una de las muestras tipo, pattern Manosa-PEG. En esta se emplearon la microscopía de fluorescencia mediante unión específica de Manosa a una proteina marcada fluorescentemente lo que nos permitió ver líneas con intensidad alta de fluorescencía donde se encontraba la manosa y líneas oscuras donde estaba el PEG . Se empleo también mapeo de XPS para estudio de la distribución de grupos funcionales . Usamos además ángulo de contacto para el estudio de la funcionalización previa (antes de la litografía óptica) de los vidrios y estudios de viabilidad celular con fibroblastos observándose unión específica de las células a las zona biomodificadas con manosa.
4-Resumen capítulo 5: Microfluídica como metodología para la generación de bio-gradientes.
En este último capítulo se llevó a cabo el empleo de una metodología como es la microfluídica para generar patternso patrones estables sobre superficies. El chip de microfluidos empleado para este fin presentaba la posibilidad de generar un gradiente de concentración en la cámara principal tras la mezcla de los reactivos en la zona de serpentines inicial. Mediante el uso de una reacción rápida desarrollada durante nuestro trabajo como es la "click reaction" y superficies de vidrio modificadas con grupos azida llegamos a crear gradientes de concentración estables sobre la superficie de vidrio para su posterior uso en áreas de biología. Se conoce de la existencia de un gran interés en el estudio de estos gradientes de concentración debido a que se ponen de manifiesto en multitud de procesos como angiogénesis y reparación de tejidos. La derivatización de las superficies de vidrio previamente modificadas usando microfluídica fue caracterizada usando ángulo de contacto y XPS. La posterior modificación de las superficies con el chip de generación de gradientes fue seguida mediante microscopia confocal ya que empleamos una molécula con emisión de fluorescencia (fluoresceína). Además el microscopio confocal nos permitió estudiar como la reacción iba ocurriendo mediante estudio simultáneo de la fluorescencia en un área alejada al vidrio y en la superficie de este. En la figura 3 que se muestra a continuación se exponen de forma resumida los resultados obtenidos en esta parte del trabajo. En la primera parte se muestra un esquema de la reacción click empleada para la derivatización de las estructuras usando microfluídica. En la segunda de las partes de muestra XPS como metodología para caracterizar antes y después de la funcionalización como variaban los grupos funcionales . Ángulo de contacto nos aportaba la misma información . La última parte mostraba el gradiente conseguido sobre la superficie de vidrio tras lavado para la eliminación de exceso sobrante de reactivos
