Mejora de la eficiencia reproductiva en ovejas rasa aragonesa mediante el uso del alelo fecxr del gen bmp15 y de la hormona anti-mülleriana (amh) como marcadores de su población folicular
- Autores: Belén Lahoz Crespo
- Directores de la Tesis: José Folch Pera (dir. tes.), José Luis Alabart Álvarez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2013
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Anselmo Gracia Molina (presid.), José Ignacio Martí Jiménez (secret.), Antonio González de Bulnes (voc.), Loys Bodin (voc.), María Teresa Paramio Nieto (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El sector ovino en Aragón constituye una actividad de gran importancia para su economía agraria, siendo la Rasa Aragonesa la principal raza ovina de la Comunidad. Pero su relevancia va más allá de la actividad económica, siendo destacable su repercusión sobre aspectos sociales y medioambientales. Sin embargo, en los últimos años se ha registrado una disminución constante del censo de ganaderías y de ovejas, lo que es un reflejo de la crisis social y económica que está atravesando el sector, habiéndose producido una pérdida de rentabilidad alarmante en los últimos años. Diversos estudios en esta raza han demostrado que la prolificidad y la fertilidad son las variables con mayor influencia sobre la rentabilidad económica de las explotaciones y por tanto sobre su supervivencia (Pardos et al., 2007). Por ello, esta tesis doctoral se planteó para buscar alternativas que aumentasen el rendimiento reproductivo de las explotaciones, en particular para avanzar en el conocimiento y la utilización de marcadores genéticos y endocrinos de la población folicular en ovejas para ser seleccionadas por su eficiencia reproductiva.
El primero de estos marcadores fue el alelo alelo FecXR ó ROA® (Rasa Oviaragón), descubierto en esta raza en el año 2007. Se trata de un nuevo polimorfismo natural en el gen BMP15, un gen mayor con gran efecto sobre el carácter prolificidad, que produce un aumento de la prolificidad en las ovejas heterocigotas (R+) y esterilidad en las hembras homocigotas (RR; Martínez-Royo et al., 2008; Jurado et al., 2008; Martínez-Royo, 2011). Dadas sus ventajas productivas, hubo un creciente interés desde su descubrimiento para su utilización en las ganaderías, pero era necesario caracterizar sus efectos a nivel reproductivo, lo que se llevó a cabo en los primeros trabajos de esta tesis.
En los primeros estudios se determinó el efecto del alelo FecXR sobre la tasa de ovulación y la prolificidad, teniendo en cuenta la aplicación o no de tratamientos hormonales, que es una práctica habitual en las ganaderías. Sus resultados dieron lugar a la publicación del artículo "Effect of the FecXR polymorphism in the bone morphogenetic protein 15 gene on natural or equine chorionic gonadotropin-induced ovulation rate and litter size in Rasa Aragonesa ewes and implications for on-farm application¿ (Journal of Animal Science 2011, 89:3522-3530).
En el primer experimento se comparó la tasa de ovulación natural de corderas y ovejas adultas portadoras del alelo FecXR en heterocigosis (R+) con la de las ovejas no portadoras (++). Este experimento se llevó a cabo con 111 corderas (91 R+ y 20 ++), y 103 ovejas adultas (84 R+ y 19 ++). Se determinó la tasa de ovulación natural durante tres ciclos consecutivos en cada animal mediante observación laparoscópica. Se observó que las hembras R+ presentaron una tasa de ovulación superior a las ++, tanto en corderas como en adultas (+0,44 y +0,63 ovulaciones, respectivamente; ambas P<0,01). En cuanto a la distribución de las ovulaciones, las corderas R+ presentaron un mayor porcentaje de ovulaciones dobles que las corderas ++ (+50,5%; P<0,01). Las ovejas adultas R+, además de un incremento de las ovulaciones dobles (+36,4%; P<0,01), también presentaron un mayor porcentaje de ovulaciones triples o de orden superior respecto a las ovejas ++ (+12,8%; P<0,05).
En el segundo experimento se trató de evaluar la posible interacción entre el genotipo y la aplicación de gonadotropinas, comúnmente utilizadas en los tratamientos comerciales de sincronización de celos. Para ello se determinó la tasa de ovulación de las ovejas adultas R+ en respuesta a dos dosis diferentes de eCG. Se estudió la influencia del incremento en la tasa de ovulación sobre la mortalidad embrionaria y el peso al nacimiento de los corderos, con el fin de determinar la dosis óptima a aplicar a las ovejas R+ en condiciones de campo. Se utilizaron 119 ovejas (71 R+ y 48 ++), que se trataron con esponjas vaginales de 30 mg de FGA durante 14 días. En el momento de la retirada de las esponjas, las ovejas ++ recibieron 480 UI de eCG im (grupo ¿++480¿), la dosis estándar que se utiliza en las ganaderías para la IA en ovejas Rasa Aragonesa, mientras que las ovejas R+ recibieron 240 UI (grupo ¿R+240¿; n=35) ó 480 UI (grupo ¿R+480¿; n=36) de eCG. A las 54±1 h de la retirada de las esponjas se realizó la IA cervical con semen refrigerado a 15°C (400×106 espermatozoides/oveja). La tasa de ovulación se determinó 8 días después de la retirada de las esponjas, durante un único ciclo. Se determinaron las pérdidas embrionarias (PFMO: Partial Failure of Multiple Ovulation). La mayor tasa de ovulación se observó en las ovejas R+ tratadas con 480 UI de eCG (3,95; P<0,01), mostrando casi un 60% de ovulaciones cuádruples o de mayor orden. Cuando se redujo la dosis a 240 UI, la tasa de ovulación de las ovejas R+ fue similar a la de las ovejas ++ que recibieron 480 UI (2,90 vs. 2,82). En el grupo ¿R+240¿ predominaron las ovulaciones triples (47,6%), mientras que en el grupo ¿++480¿ predominaron las dobles (42,4%). El mayor PFMO se observó en el grupo ¿R+480¿ (1,85; P<0,05), mientras que no hubo diferencias significativas entre los grupos ¿R+240¿ y ¿++480¿.
En el tercer experimento se determinó la prolificidad de las ovejas adultas R+ tratadas o no con eCG en las ganaderías que forman parte del programa de mejora genética por prolificidad de la UPRA-Grupo Pastores. Para ello fue necesario en primer lugar, validar la asignación por genealogía como un método de identificación de las hembras R+ nacidas en los rebaños antes del descubrimiento de la mutación en BMP15, por lo que se comparó este método con el genotipado por PCR. Se observó que la asignación del genotipo por genealogía fue consistente con la identificación por PCR (98% de hembras correctamente clasificadas). Para el cálculo de prolificidad se analizaron un total de 668.674 registros de partos, recogidos en el control de producciones desde 1998 hasta 2008. Dentro de cada genotipo, los partos se dividieron en 2 grupos dependiendo de si la cubrición se llevó a cabo en condiciones naturales (++: n=599.160; R+: n=6.593) o tras la aplicación de un tratamiento de esponja de FGA y 480 UI de eCG (++: n=62.055; R+: n=866). Se observó que en ovejas no tratadas la presencia del alelo FecXR aumenta la prolificidad en 0,35 corderos por oveja y parto (P<0,0001). Cuando se aplica eCG, esta diferencia de prolificidad entre genotipos es de 0,30 corderos más por oveja R+ y parto (P<0,0001). Este incremento de prolificidad observado en las ovejas R+ tratadas se debió únicamente a un incremento de los porcentajes de partos triples (+4,4%; P<0,001) y cuádruples (+2,0%; P<0,0001).
Teniendo en cuenta las diferencias encontradas en tasa de ovulación, y dado el uso habitual de la inseminación artificial a tiempo fijo y el número creciente de hembras R+ en las ganaderías, el siguiente experimento tuvo por objeto estudiar el pico preovulatorio de LH en ambos genotipos con el fin de determinar posibles diferencias endocrinas entre ellos. Sus resultados dieron lugar a la publicación del artículo ¿Caracterización del pico preovulatorio de LH en ovejas Rasa Aragonesa portadoras o no del alelo FecXR (ROA®)¿ (ITEA-Información Técnica Económica Agraria 2013; DOI: http://dx.doi.org/10.12706/itea.2013.025). Se utilizaron 50 ovejas, que se dividieron en 5 lotes de 10 ovejas dependiendo de su genotipo y del tratamiento hormonal (mismos grupos que en los estudios de tasa de ovulación). Se tomaron muestras sanguíneas para el análisis de LH durante 72 horas (1 muestra cada 6 horas durante las primeras 24 horas, y 1 muestra cada 4 horas de las 24 a las 72 horas). Las muestras se analizaron mediante un kit comercial ELISA (LH-DETECT, ReproPharm, Tours INRA, Nouzilly, Francia). No se observaron diferencias significativas en el pico de LH entre ovejas R+ y ++. La eCG adelantó el pico de LH en ambos genotipos, sin diferencias entre ovejas R+ tratadas con 240 ó 480 UI. Cuando se aplicó la dosis estándar de 480 UI a las ovejas ++, se logró una gran sincronización del pico de LH, de forma que el 90% de los animales lo presentó entre las 36 y 40 h. Sin embargo, se observó una mayor dispersión en las ovejas R+ tratadas.
Los efectos observados del alelo FecXR sobre la tasa de ovulación podían conllevar cambios a nivel de la población folicular que afectasen a la calidad del oocito y a la fertilidad, por lo que se vio la conveniencia de profundizar en el conocimiento de sus efectos a ese nivel. Para ello se evaluó la influencia del alelo FecXR sobre el número y tamaño de los folículos ováricos y su repercusión sobre la calidad del oocito, utilizando técnicas de producción in vitro y transferencia de embriones (TE) a partir de oocitos derivados de LOPU. Estos resultados dieron lugar a la publicación del artículo ¿Influence of the FecXR allele in heterozygous ewes on follicular population and outcomes of IVP and ET using LOPU-derived oocytes¿ (Reproduction in Domestic Animals 2013, 48, 717¿723). Se llevaron a cabo dos ensayos de LOPU-PIV (Laparoscopic Ovum Pick Up-Producción In Vitro), utilizando como donantes de oocitos 8 ovejas R+ y 8 ++. En cada ensayo se realizaron 4 sesiones de LOPU separadas 7 días, las dos primeras sin aplicar FSH y las 2 últimas aplicando un tratamiento de estimulación ovárica con 32 mg de FSH porcina. Se aspiraron todos los folículos ováricos mayores o iguales a 3 mm. Los COCs (complejo cumulus-oocito) recuperados se transportaron al laboratorio para su posterior maduración (MIV), fertilización (FIV) y cultivo (CIV) in vitro. Se evaluaron las tasas de división y de blastocistos a las 48 horas y a los 7 y 8 días de la FIV. La viabilidad de los blastocistos producidos in vitro se evaluó por su capacidad para llevar a término la gestación. Para ello se transfirieron blastocistos de todos los grupos experimentales y de ambos ensayos, tanto de día 7 como de día 8, a un total de 48 ovejas receptoras sincronizadas. Los resultados mostraron que el genotipo no tuvo ningún efecto sobre el número de folículos aspirados por oveja y sesión (10,4 y 10,2 en R+ y ++ no tratadas; 17,4 y 14,3 en R+ y ++ tratadas con FSH). Sin embargo, el diámetro folicular fue significativamente menor en las ovejas R+ (-0,2 mm en ovejas no tratadas y -0,8 mm en ovejas tratadas con FSH, P<0,01). El tratamiento con FSH aumentó el tamaño folicular en ambos genotipos, aunque de diferente manera: produjo un mayor incremento del número de folículos de 4 mm en las ovejas R+, mientras que a la inversa, incrementó más el número de folículos ¿6 mm en las ovejas ++ (P<0,01 para ambos). En las ovejas R+ se obtuvo una mayor tasa de recuperación, que conllevó un aumento del número total de COCs así como del número de COCs aptos para MIV. Aunque los folículos de las ovejas R+ fueron menores, se observaron tasas similares de blastocistos de día 8 en ovejas R+ (36,1%, 147/407) y ++ (32,6%, 100/307). El resultado global de blastocistos de día 8 por oveja y por sesión fue mayor en las ovejas R+ (+0,75; P<0,005), sin observarse ninguna diferencia en la tasa de supervivencia al nacimiento de los embriones transferidos (40,4% en R+ vs. 36.4% en ++).
El siguiente marcador que se estudió en esta tesis fue la hormona Anti-Mülleriana (AMH). La AMH es en la actualidad uno de los mejores marcadores endocrinos de la reserva folicular ovárica en varias especies, por lo que se pensó que su uso en ovino podría contribuir a mejorar la eficiencia de las biotecnologías embrionarias. Actualmente, en los rebaños de Rasa Aragonesa las hembras FecXR heterocigotas conviven con las no portadoras. Basándonos en estudios previos, trabajamos sobre la hipótesis de que la disminución de la proteína BMP15 biológicamente activa a nivel del ovario que ocurre en las ovejas R+ podría afectar la producción de AMH de los folículos en crecimiento y por lo tanto sus concentraciones plasmáticas. Con este objetivo, en este experimento se investigó la relación entre la concentración plasmática de AMH en función de la edad, la presencia del alelo FecXR del gen BMP15 y la población folicular. Estos estudios dieron lugar a la publicación del artículo ¿Anti-Müllerian hormone (AMH) concentration in sheep and its dependence of age and independence of BMP15 genotype: an endocrine predictor to select the best donors for embryo biotechnologies¿ (Theriogenology 2013, DOI: 10.1016/j.theriogenology.2013.09.033). El experimento se inició con doce corderas, 6 R+ y 6 ++, nacidas en abril, con una diferencia de edad máxima entre ellas de 3 días. Se obtuvieron tres muestras sanguíneas para la determinación de AMH de cada cordera a los 90, 135 y 180 días de edad. Cuando alcanzaron la edad adulta (19 meses), diez de ellas junto con otras seis ovejas similares en edad (total 8 R+ y 8 ++), fueron sometidas a 4 sesiones de LOPU, siguiendo la metodología descrita en el experimento anterior, para relacionar la AMH con la población folicular. Se obtuvieron cuatro muestras sanguíneas de cada oveja para la medición de AMH de la siguiente manera: en las sesiones 1 y 2, en las que no se aplicó FSH, coincidiendo con la punción folicular, y en las sesiones 3 y 4, en las que se aplicó FSH antes de la LOPU, coincidiendo con la primera inyección de FSH. Las concentraciones plasmáticas de AMH se analizaron con el kit AMH GenII Kit ELISA (Beckman Coulter, Francia). No se observaron diferencias en la concentración plasmática de AMH entre ovejas R+ y ++, ni antes de la pubertad, ni en la edad adulta. Antes de la pubertad, la concentración de AMH aumentó de los 3 a los 4,5 meses, y luego disminuyó a los 6 meses hasta niveles similares a los observados en la edad adulta (333,8±73,3, 483,2±135,5 y 184,1±38,2 pg/ml, respectivamente, P<0,1), demostrando una gran variabilidad interindividual. Aunque el pico de AMH se observó de media a los 4,5 meses, hubo animales que lo presentaron antes, y otros después, lo que parecería indicar que la AMH estaría reflejando un desarrollo folicular más avanzado en unas corderas respecto a otras. Como consecuencia, no se encontró una relación entre la AMH en la edad prepúber y la AMH o el número de folículos aspirados en la edad adulta. En la LOPU, la concentración de AMH al inicio del tratamiento con FSH estuvo muy correlacionada con el número de folículos aspirados, tanto en R+ como en ++ (r=0,75 y 0,78, respectivamente, P<0,001). Según nuestros resultados, por cada 100 pg/ml adicionales de AMH se podría esperar una media de 5,1 folículos adicionales (P<0,0001). Se pudo determinar de manera precisa un cutoff o ¿punto de corte¿ óptimo para cada genotipo que permitiría identificar y seleccionar las ovejas adultas con una mayor respuesta a la FSH (¿18 folículos puncionados por sesión).
Como se había visto que la concentración de AMH era capaz de reflejar de manera fiable la población folicular en ovejas adultas, en esta tesis se planteó como objetivo estudiar la posible relación entre los niveles plasmáticos de AMH y la población folicular sensible a gonadotropinas en corderas prepúberes, como posibles marcadores de precocidad sexual y fertilidad en la edad adulta. Este objetivo venía justificado porque en esta raza se había observado que existe un retraso en la edad media al primer parto que conlleva importantes pérdidas económicas. Los resultados de este experimento dieron lugar a la publicación del artículo ¿Anti-Müllerian hormone plasma concentration in prepubertal ewe lambs as a predictor of their fertility at a young age¿ (BMC Veterinary Research 2012, 8:118). El experimento comenzó en julio con 76 corderas prepúberes de alrededor de 3,6 meses de edad y de peso similar. Con el fin de determinar la presencia de folículos sensibles a gonadotropinas a esta edad, se les aplicó 600 UI de eCG im, inmediatamente después de tomar muestras sanguíneas mediante punción yugular con tubos de heparina de litio. Seis días después se determinó la ovulación mediante laparoscopia. El análisis de AMH se llevó a cabo con el Kit de activo MIS/AMH ELISA (Beckman Coulter Francia, Roissy Charles de Gaulle, Francia). Con el fin de estudiar la relación entre la AMH y la fertilidad temprana, cuando las ovejas tuvieron 312±18 días de edad (enero), se pusieron a cubrir con cuatro machos adultos durante 34 días. Cuatro meses más tarde las ovejas que no quedaron gestantes se cubrieron de nuevo durante 34 días. Se determinó un punto de corte (cutoff) óptimo de los valores de AMH en la edad prepúber para identificar a las ovejas con mayor fertilidad en la primera cubrición, para lo que se realizó un análisis ROC. La AMH se detectó en la mayor parte de las corderas (93%). Las concentraciones de AMH en las corderas prepúberes se relacionaron con la presencia de ovulación tras la administración de eCG. De esta manera, las concentraciones de AMH fueron alrededor de 3¿4 veces mayores en las corderas que ovularon que en las que no (P<0,004), lo que sugirió que la AMH estaba reflejando la existencia de una población de folículos capaces de responder a las gonadotropinas en la mayoría de las corderas a esa edad. La fertilidad de las ovejas adultas en su primera cubrición (10 meses) estuvo correlacionada positivamente con su concentración de AMH en la edad prepúber (¿=0,34, p<0,01). En este trabajo se determinó un cut-off o punto de corte de 97 pg/ml de AMH a los 3,6 meses de edad como el más adecuado para predecir la fertilidad en la primera cubrición. Así, la fertilidad de la primera cubrición fue 34,8 puntos porcentuales mayor en las ovejas con AMH¿97 pg/ml en la edad prepúber que en las que presentaron valores inferiores (P<0,001).
Las conclusiones de la presente tesis doctoral fueron las siguientes: 1. El alelo FecXR en heterocigosis produce un incremento de la tasa de ovulación de +0,44 ovulaciones en corderas y de +0,63 ovulaciones en ovejas adultas, que se traducen en un incremento de la prolificidad de 0,35 corderos por parto.
2. Las ovejas heterocigotas para FecXR presentan una mayor respuesta a la eCG, de manera que la dosis estándar de 480 UI da lugar a una tasa de ovulación excesivamente elevada que conlleva un porcentaje elevado de ovulaciones cuádruples y de mayor orden, así como elevadas pérdidas embrionarias. En las ganaderías, esto origina un incremento extra de la prolificidad debido exclusivamente a un incremento de los partos triples y de mayor orden. Cuando se reduce a la mitad la dosis de eCG que se aplica a las ovejas heterocigotas para FecXR, se consiguen tasas de ovulación y pérdidas embrionarias similares a las obtenidas en las ovejas no portadoras que reciben la dosis estándar.
3. La presencia del alelo FecXR en heterocigosis no afecta al pico preovulatorio de LH. Cuando se aplica eCG, el pico preovulatorio se adelanta en ambos genotipos, pero sin diferencias entre ellos, independientemente de aplicar a las hembras heterocigotas 480 ó 240 UI. Por ello, se puede realizar la inseminación artificial a tiempo fijo en el mismo momento en ambos genotipos.
4. La presencia del alelo FecXR en heterocigosis da lugar a una disminución en el tamaño medio de los folículos ováricos, principalmente por una disminución en el número de folículos >6 mm. A pesar de ello, sus oocitos han demostrado ser tan competentes como los de las no portadoras, lo que concuerda con los resultados de fertilidad observados en las ganaderías. Se observa una mayor eficiencia de este genotipo en el rendimiento de producción in vitro, debido principalmente a una mayor respuesta a la FSH.
5. No existen diferencias en la concentración plasmática de la hormona anti-Mülleriana entre las ovejas heterocigotas del alelo FecXR y las no portadoras, por lo que la capacidad predictiva de la AMH puede hacerse extensiva a ambos genotipos.
6. En la edad adulta, la hormona anti-Mülleriana ha demostrado ser un buen predictor del número de folículos ováricos capaces de responder a las gonadotropinas, por lo que puede utilizarse como método de selección de las mejores donantes de oocitos para mejorar la eficiencia de las biotecnologías embrionarias en ovino.
7. La hormona anti-Mülleriana está presente en el plasma sanguíneo de corderas prepúberes, mostrando una gran variabilidad entre individuos y edades. A esta edad, se relacionó con la aparición de la ovulación tras la administración de eCG, siendo mucho mayor en las corderas que ovularon que en las que no. Se relacionó positivamente con la fertilidad en la primera cubrición, pero no con las concentraciones de AMH ni con el rendimiento en LOPU en la edad adulta.
En resumen, los trabajos presentados en esta tesis se enmarcan en la búsqueda de alternativas para aumentar la eficiencia reproductiva de las explotaciones ovinas con el objetivo de mantener en el rebaño únicamente a las ovejas más productivas. Para ello se han estudiado en la raza Rasa Aragonesa dos marcadores relacionados con su población folicular, que actúan a través de mecanismos diferentes. Ambos indicadores se pueden determinar antes de la pubertad, en el momento en que el ganadero elige la reposición, y son indicadores de la capacidad reproductiva de las ovejas en su estado adulto. El primero de ellos, el polimorfismo FecXR en el gen BMP15, produce en heterocigosis un aumento de la tasa de ovulación que conlleva un aumento de la prolificidad del 26% (0,35 corderos por parto), sin efectos adversos a nivel de mortalidad embrionaria, peso de los corderos, perfil de LH o fertilidad. El segundo marcador es la AMH, que ha demostrado ser un indicador de la precocidad sexual en las corderas, y que es un marcador de la población folicular sensible a las gonadotropinas en las ovejas adultas. Se puede alcanzar un incremento de 21,1 puntos en la fertilidad en la primera cubrición seleccionando las corderas con mayor AMH. No se ha encontrado una interacción entre la concentración de AMH y la presencia del alelo FecXR en heterocigosis, por lo que se pueden utilizar de manera complementaria para elegir las ovejas más eficientes.
