Resumen de Aportaciones al conocimiento de la patogenia y transmisión del scrapie en infección natural
El scrapie ovino es una enfermedad contagiosa conocida desde el siglo XVIII que ha sido objeto de un estudio más detallado en las últimas décadas debido principalmente a su relación con la encefalopatía espongiforme bovina (EEB), responsable de la crisis alimentaria más importante registrada en la Unión Europea. Aun así, numerosos aspectos relacionados con esta enfermedad todavía se desconocen. El objetivo principal de esta tesis, desarrollado en 4 capítulos diferentes, es contribuir al conocimiento de la patogenia y transmisión del scrapie. Gran parte de los estudios existentes se han realizado utilizando modelos experimentales o animales infectados de forma natural que presentan un genotipo altamente susceptible (VRQ/VRQ). Dado que el genotipo del gen PRNP influye notablemente en la patogenia de la enfermedad, los estudios realizados en la presente tesis se han centrado en animales infectados de forma natural y que presentan principalmente el genotipo ARQ/ARQ, ya que es el genotipo ancestral y el más frecuente en las razas ovinas españolas.
En el primer capítulo de la tesis se realiza un estudio detallado de la distribución de la PrPSc en ovinos infectados de forma natural de scrapie, utilizando las técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) y ELISA. Aunque la acumulación de la PrPSc en el sistema nervioso central (SNC) es una característica de las EETs, en algunas de estas enfermedades como el scrapie ovino, la enfermedad crónica caquectizante de los ciervos y la variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob humana, la PrPSc se acumula también en otros tejidos no nerviosos, principalmente en el sistema linforreticular (SLR). En los últimos años, se han ido realizando descripciones de otros órganos no nerviosos ni linfoides que presentan depósitos de PrPSc, lo que sugiere que la distribución de esta proteína en el organismo de individuos que padecen una EET puede ser mucho más amplia de los que se ha considerado hasta ahora. Excepto en el útero y el ovario, en el presente estudio se han detectado depósitos de PrPSc en todos los órganos analizados: glándula adrenal, riñón, corazón, músculo, pulmón, glándula mamaria, piel, hígado, lengua, páncreas y vejiga. Por primera se describe la acumulación de la PrPSc en corazón, páncreas y vejiga. En otros de los órganos estudiados, se ha observado la acumulación de PrPSc en localizaciones hasta ahora no descritas: glomérulo renal, fascículos nerviosos y epitelio de conductos de la glándula mamaria, epidermis, epitelio bronquiolar y tabiques alveolares del pulmón y en folículos linfoides en hígado asociados a una inflamación producida por parásitos. Excepto en el riñón y la placenta, los depósitos de PrPSc están generalmente asociados al sistema nervioso periférico que inerva los distintos órganos y/o a la existencia de lesiones inflamatorias crónicas. Con la excepción del pulmón, en todos los órganos la PrPSc se detectó mediante las dos técnicas incluidas en el estudio (IHQ y ELISA) en al menos un animal. Los resultados de este trabajo de tesis muestran una amplia diseminación de esta proteína en el organismo, incluso en algunos animales en los que la implicación del SLR era muy escasa. Estos resultados indican como potencialmente infecciosos órganos que hasta el momento no eran considerados como tales, contribuyendo así a una mejor evaluación del riesgo que supone la inclusión de diversos órganos procedentes de animales infectados en la cadena alimentaria y su utilización para la elaboración de determinados productos, como medicamentos. Además, los datos obtenidos en esta tesis sobre la patogenia de la enfermedad pueden aportar información indirecta relacionada con la infectividad de los tejidos procedentes de personas que padecen una EET, importante en el contexto de una potencial transmisión iatrogénica de estas enfermedades La placenta es el tejido no nervioso ni linfoide en el que se acumula una mayor cantidad de PrPSc y es considerado el de mayor riesgo en la transmisión del scrapie en condiciones naturales. En el segundo capítulo de esta tesis se profundiza en el estudio de la acumulación de la PrPSc en la placenta utilizando técnicas de detección convencionales (IHQ, ELISA y WB) y técnica de amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA) que tiene una alta sensibilidad. Los resultados del presente estudio confirman que el genotipo del feto es el factor determinante en la acumulación de PrPSc en la placenta. La utilización de la técnica de PMCA confirma que la presencia del haplotipo ARR en el feto inhibe totalmente la acumulación de PrPSc en la placenta. Los resultados de los estudios realizados con otros haplotipos como ARQ, ARH, AHQ, ARK sugieren que las diferencias entre el genotipo materno y el fetal (incluso en un solo polimorfismo) inhiben parcial o totalmente la acumulación de PrPSc en la placenta; así, en algunos de estos casos, aunque la PrPSc no se pudo detectar mediante la utilización de técnicas convencionales, se demostró mediante la PMCA.
La edad gestacional parece ser otro factor determinante en la acumulación de PrPSc en la placenta. Mediante técnicas convencionales se detectaron placentas positivas a partir de los 3 meses de gestación, mientras que la PMCA permitió detectar la proteína patológica a partir de los 2 meses. El inicio de la acumulación de la PrPSc se corresponde con el momento de la formación de hematomas en torno a la base de las vellosidades fetales, característico de la placentación de rumiantes. Las características, localización y evolución de los depósitos de PrPSc sugieren la vía hematógena como forma de acceso de los priones a la placenta. Los trofoblastos localizados en torno a los hematomas podrían fagocitar la sangre materna infectada adquiriendo así la PrPSc; la migración y fusión de los trofoblastos binucleados con el endometrio materno formando placas sincitiales, sería la forma de diseminación de la PrPSc por el todo placentoma. Así mismo, la presencia de capilares fetales en posición intraepitelial en el trofoectodermo permitiría el acceso de la PrPSc a partir de los trofoblastos a la sangre fetal, contaminando así el feto.
En el tercer capítulo de esta tesis se describe la presencia de la PrPSc en líquido amniótico y tejidos fetales procedentes de madres infectadas de scrapie en fase avanzadas de la enfermedad y que presentaban una amplia distribución de esta proteína en el organismo. La proteína patológica se pudo detectar únicamente tras su amplificación mediante la técnica de PMCA, lo que indica que se encuentra en muy pequeñas cantidades. Estos resultados representan la primera detección de la PrPSc en tejidos fetales, sugiriendo que la transmisión in utero de scrapie podría ser posible.
El hecho de que grandes cantidades de PrPSc pueden ser eliminadas en las placentas de animales vivos infectados de scrapie, hace que este tejido pueda utilizarse para el diagnóstico in vivo de la enfermedad. Sin embargo, la sensibilidad de esta metodología no está bien caracterizada debido a que los estudios realizados hasta el momento son escasos y utilizan un bajo número de muestras. En el capítulo 2 se analizan un total de 102 placentas mediante técnicas rápidas (IDEXX Herd Chek® BSE-Scrapie Antigen Test kit, BioRad TeSeETM sheep/goat, Prionics®-Check WESTERN SR) e IHQ, 83 de ellas procedentes de ovejas infectadas. Aunque estas técnicas rápidas se utilizan para la detección de PrPSc en el tejido nervioso, todas permitieron la detección de esta proteína en el tejido procedente de placentas. Considerando una muestra positiva aquella que daba un resultado positivo en al menos 2 de las técnicas utilizadas, la técnica de IDEXX detectó el 81% de las muestras positivas, la de Prionics el 76% y al de BioRad el 26%. La modificación de estas técnicas para su utilización en tejido procedente de placentas mejoró notablemente la sensibilidad de las mismas, especialmente en el caso de BioRad (88% IDEXX y Prionics y 44% BioRad). Respecto a la técnica de IHQ, aunque fue la técnica que mostró una mayor sensibilidad, la presencia de inmunotinciones inespecíficas y pigmentos dificultó en gran medida el diagnóstico. Los resultados del presente estudio muestran un alto porcentaje (63%) de animales infectados que no presentan depósitos de PrPSc detectables mediante técnicas convencionales en la placenta. La utilización de este tejido como muestra para el diagnóstico del scrapie presenta por lo tanto importantes limitaciones debido principalmente a la influencia del genotipo del feto y la edad gestacional.
A pesar de que la placenta de ovejas infectadas de scrapie puede albergar una gran cantidad de PrPSc y altos niveles de infectividad, no se ha descrito ningún otro cambio morfológico evidente en esas placentas, siendo desconocidos los efectos de la presencia de PrPSc sobre la función normal de la misma. En las placentas procedentes de animales infectados de scrapie, la PrPSc se asocia al trofoblasto, cuyas células son encargadas de la síntesis de hormonas y proteínas asociadas a la gestación (PAG). Estas hormonas y proteínas intervienen en el establecimiento y mantenimiento de la gestación, por lo que la presencia de la PrPSc en estas células podría dar lugar a alteraciones de la homeostasis endocrina de la gestación. En el Capítulo 4 de esta tesis se analizaron los niveles plasmáticos de progesterona, prolactina y proteínas asociadas a la gestación (PAG) durante la primera mitad de la gestación. Aunque se observaron diferencias en los niveles de progesterona y PAG-I entre ovejas sanas y enfermas, no se detecto ningún efecto de las variables estudiadas en los niveles de prolactina. Las mayores diferencias en los niveles de PAG-I entre animales infectados y sanos ocurrieron sobre el día 75 de gestación, pudiendo estar asociado con el comienzo de acumulación de la PrPSc en placenta. Por otro lado, las modificaciones en los niveles de progesterona podría ser consecuencia de las alteraciones en los mecanismos involucrados en la biosíntesis del colesterol inducidos por priones.
Los cuatro estudios han cubierto los objetivos planteados en la tesis, aportando nuevos datos sobre la patogenia y transmisión de la enfermedad. Se ha demostrado una amplia diseminación de la PrPSc en el organismo, así como la presencia de esta proteína en órganos y localizaciones no descritas previamente. El estudio de la acumulación de la PrPSc en la placenta, ha permitido confirmar el efecto decisivo del genotipo fetal en dicha acumulación y consecuentemente en la transmisión del scrapie. Así mismo, se ha detectado por primera vez la presencia de PrPSc en diferentes tejidos fetales procedentes de ovejas infectadas de scrapie, utilizando una técnica de alta sensibilidad. Por último, los resultados de esta tesis sugieren una alteración funcional de las placentas procedentes de animales infectados de scrapie.
