Caracterización molecular y fenotípica del agente causal en casos no concluyentes de encefalopatías espongiformes transmisibles animales
- Autores: Rocio Sarasa Orcastegui
- Directores de la Tesis: Juan José Badiola Díez (dir. tes.), Marta Monzón Garcés (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2012
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: André-Laurent Parodi (presid.), Eva Monleón Moscardó (secret.), María Antonia Vargas Vargas (voc.), Adolfo Toledano Gasca (voc.), Martí Pumarola i Batlle (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EET) son un grupo de enfermedades neurodegenerativas que, tras un largo periodo de incubación, provocan la muerte. El origen de la enfermedad reside en el cambio conformacional de una proteína localizada fisiológicamente en el tejido nervioso (proteína prión celular, PrPc) que adquiere características patológicas (PrPsc), siendo el único agente causal conocido y denominado prión. La identificación de los depósitos de PrPsc en el tejido nervioso central se considera específica de la enfermedad y en ello se basan la mayoría de las técnicas diagnósticas. Aunque estas enfermedades afectan a varias especies animales, además de a la humana, las más importantes son la enfermedad bovina (Encefalopatía espongiforme bovina), ovina y caprina (Scrapie), la del visón (Encefalopatía transmisible del visón) y la que afecta a cérvidos (enfermedad crónica caquectizante). El presente trabajo se ha centrado en la primera de ellas, la Encefalopatía espongiforme bovina (EEB).
Tras la aparición de la EEB y el incremento progresivo en el número de casos de la enfermedad bovina desde 1987 y, particularmente, tras la demostración de la transmisión de ésta a humanos (variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, vECJ), se consideró absolutamente necesario disponer de métodos de diagnóstico sensibles y específicos. Por otra parte, el elevado número de animales a analizar obligó a disponer de técnicas de diagnóstico rápido, aunque ello supusiera una cierta pérdida en su sensibilidad.
En el curso del programa de vigilancia de la EEB establecido para la identificación de los casos de la enfermedad y la aplicación de las correspondientes medidas de control de la misma, uno de los problemas que surgió fue la existencia de muestras que ofrecían resultados no concluyentes.
En este trabajo se han estudiado varias muestras que no presentaron un resultado concluyente con las técnicas de confirmación aplicadas de rutina, inmunohistoquímica (IHQ) y Western blot (WB), y que además presentaban un estado muy avanzado de autolisis. El objetivo planteado era analizar estas muestras mediante la aplicación de las técnicas de confirmación establecidas por la OIE, adaptándolas a las características que presentaban. Pero, además, se planteó realizar por primera vez una comparación exhaustiva sobre la capacidad de cada una de ellas para llevar a cabo el diagnóstico de este tipo de muestras.
Para el estudio, se han seleccionado 5 muestras de tejido encefálico bovino que presentaban un avanzado estado de autolisis y que habían sido diagnosticadas como muestras no concluyentes.
Con la técnica rápida utilizada (Prionics-Check Western test) estas muestras evidenciaron una señal, pero no lo suficientemente evidente como para ser consideradas como positivas, por lo que se aplicaron todas las técnicas de confirmación establecidas por la OIE, todas ellas con modificaciones debido al carácter autolítico que presentaban y, también, teniendo en consideración la hipótesis de que se pudiera partir de una cantidad muy baja de PrPsc.
Las técnicas diagnósticas de confirmación fueron la inmunohistoquímica (IHQ), el Western blot (WB; SAF Immunoblot), la visualización de las fibrillas asociadas a Scrapie (SAF) mediante microscopía electrónica y el bioensayo en ratón. No fue posible utilizar la histología en estas muestras a causa de su autolisis. Por otra parte, se llevó a cabo también una técnica de diferenciación (WB) para intentar determinar el agente causal involucrado en estas muestras y evaluar la posibilidad de que una nueva cepa, diferente a la convencional, pudiera estar presente en ellas.
Respecto al resultado obtenido con las técnicas de confirmación aplicadas en este trabajo, se ha observado que la inmunohistoquímica y la microscopía electrónica han sido capaces de confirmar el resultado positivo de las muestras, mientras que el Western blot sólo ha mostrado algunos signos de positividad, pero sin lograr confirmar el diagnóstico. El bioensayo en ratón ha mostrado eficacia, pero no total, al transmitir la enfermedad sólo en un número limitado de ratones.
La inmunohistoquímica ha permitido confirmar la positividad de las muestras al revelar depósitos de PrPsc en todas ellas, aunque fue preciso previamente realizar una adaptación del protocolo convencional debido al estado autolítico de las mismas. Dicha adaptación de la técnica para muestras con avanzado estado de autolisis había sido establecida con anterioridad en el Centro de Investigación en Encefalopatías y Enfermedades Transmisibles Emergentes, pero en este trabajo se ha corroborado por primera vez en modelo in vivo la eficacia de la técnica y su alta sensibilidad, lo que la convierte en una técnica adecuada y fiable para el diagnóstico de la EEB, a pesar del estado autolítico de las muestras analizadas.
Del mismo modo, la microscopía electrónica se ha revelado como una técnica muy sensible y objetiva para diagnosticar esta clase de muestras, ya que ha permitido confirmar los resultados observados en la inmunocitoquímica mediante la visualización de SAF, estructuras formadas por PrPsc que sólo aparecen en animales afectados por la enfermedad. A pesar de que la sola observación de las fibrillas es suficiente para realizar un diagnóstico definitivo, este hallazgo ha sido corroborado con la aplicación de la inmunohistoquímica con oro coloidal, al unirse las partículas de oro a la PrPsc localizada en las fibrillas.
La aplicación del Western blot de la OIE no ha ofrecido un resultado concluyente porque, a pesar de realizar previamente todos los protocolos de concentración y purificación, sólo se ha obtenido una señal muy débil. Con el WB de diferenciación se ha podido observar una señal sugestiva de positividad, pero también débil, por lo que no ha sido suficiente para determinar el patrón de glicosilación correspondiente al agente causal presente en las muestras analizadas.
Respecto al bioensayo, en este trabajo se evidencia que esta técnica puede presentar en algunas ocasiones problemas para obtener un diagnóstico concluyente en este tipo de muestras. Aunque se ha confirmado la positividad de las muestras bovinas, ya que en cada uno de los grupos inoculados con las diferentes muestras se han detectado ratones positivos, el número de éstos ha sido muy reducido. Por otra parte, el depósito de PrPsc en placa, característico de la inoculación de EEB en la especie murina, sólo se ha observado en un ratón, a diferencia del resto de animales que han presentado depósitos de PrPsc con un patrón granular. Los resultados obtenidos por inmunohistoquímica en este modelo in vivo se han corroborado al detectarse SAF mediante la técnica de la microscopía electrónica.
El conjunto de los resultados obtenidos en este estudio, mediante la aplicación de todas las técnicas utilizadas, puede ser explicado por la naturaleza y características de las muestras estudiadas. Así, parece que la autolisis no afecta en gran medida al diagnóstico de las muestras, ya que no logra impedir la obtención de un resultado concluyente en ellas.
Por otro lado, la posibilidad de la presencia de una cepa con nuevas características no ha podido ser descartada.
La explicación más probable para todos los resultados obtenidos con las técnicas aplicadas parece ser la baja concentración de PrPsc de partida presente en las muestras bovinas, que justificaría los resultados obtenidos en este estudio. Esta hipótesis se reforzaría si se tiene en cuenta la digestión enzimática que está asociada a los procesos de autolisis y que implicaría una disminución adicional de esa concentración de partida. Ello podría explicar el mayor tiempo de incubación de los animales inoculados respecto al observado en otros estudios similares, la presencia del depósito de PrPsc granular (no en placa) visto en la mayoría de los animales inoculados, así como el menor número y tamaño de las SAF visualizadas por microscopía electrónica. Por otra parte, la falta de concordancia entre los animales con signos clínicos y su respuesta en técnicas de confirmación observada en algunos casos, podría ser explicada por la posibilidad de requerir periodos más largos de incubación asociados a la baja concentración de PrPsc, aunque también podría deberse a una relación no exclusiva entre la presencia de PrPsc y la infectividad, como ya ha sido sugerida por algunos autores.
