Resumen de Desarrollo de metodologías analíticas innovadoras para la caracterización de nanopartículas inorgánicas funcionalizadas
El auge experimentado por la Nanociencia y Nanotecnología en las últimas décadas ha dado lugar a la aparición de nuevos nanomateriales con propiedades únicas de gran valor en numerosos campos científico-tecnológicos. Entre ellos, cobran una gran relevancia en la Química Analítica, las nanopartícuas fotoluminiscentes, ya que presentan unas propiedades ópticas y electrónicas excepcionales. Estas propiedades pueden explotarse para el desarrollo de nuevas metodologías de (bio)análisis con prestaciones superiores a las existentes actualmente, desde sensores lumiscentes hasta aplicaciones de liberación controlada de fármacos.
Sin embargo, a la hora de explotar con éxito las propiedades de las nanopartículas en (bio)análisis se precisa de una caracterización exhaustiva del nanomaterial. Así, es necesario conocer con precisión parámetros tales como el tamaño, sus propiedades ópticas, la concentración, la composición química, la estabilidad, el comportamiento en distintos medios etc.
Además, el desarrollo de la mayoría de las aplicaciones (bio)analíticas requiere de la unión de las nanopartículas a elementos que reconozcan/respondan al analito (anticuerpos, fluoróforos, aptámeros etc.). En estos casos, el éxito o el fracaso de la aplicación estará determinado por la eficacia alcanzada en el proceso de funcionalización/(bio)conjugación de las nanopartículas a dichos elementos de reconocimiento. La presente Tesis Doctoral persigue el desarrollo de metodologías analíticas que sirvan para caracterizar adecuadamente las nanopartículas, desde el proceso de síntesis y recubrimiento de su superficie hasta las reacciones de (bio)conjugación posteriores.
En este contexto, el objetivo principal de la presente Tesis Doctoral consistió en el desarrollo y evaluación de metodologías analíticas basadas en el empleo de técnicas de detección molecular, elemental e isotópica para llevar a cabo la detección y caracterización de nanopartículas inorgánicas funcionalizadas.
Este objetivo general se abordó a través de los siguientes objetivos parciales: 1. Acoplamiento de la técnica de separación de flujo en campo de flujo asimétrico (AF4) a detectores moleculares (UV-vis y fluorescencia) y elementales (ICP-MS), para la caracterización de los productos derivados de la síntesis de QDs estabilizados en medio acuoso, así como para monitorizar el proceso de síntesis y transformación de “nanoclusters” metálicos.
Se propone la combinación de una técnica de separación como AF4, capaz de separar mezclas de nanopartículas presentes en una muestra en función de su tamaño, y la información proporcionada por detectores moleculares y elementales acoplados en línea a esta técnica de separación para identificar y caracterizar los productos obtenidos tras la síntesis y funcionalización de QDs (tipo CdSe/ZnS QDs). Además, la metodología se ensayó para estudiar los mecanismos de crecimiento y transformación de nanoclusters de plata (AgNCs) durante la síntesis y tras la exposición a radiación UV.
2. Determinación de la estequiometría fluoróforo:nanopartícula funcionalizada.
Las nanopartículas luminiscentes han demostrado ser especialmente útiles en el desarrollo de aplicaciones (bio)analíticas. Además, en el caso en que la nanopartícula no presente fluorescencia intrínsica, éstas pueden convertirse en luminiscentes funcionalizándolas con fluoróforos adecuados. En este caso, la determinación de la estequiometría (relación fluoróforo:nanopartícula) es necesaria para tener éxito en la preparación de plataformas cuantitativas de (bio)análisis. Este objetivo persiguió el desarrollo de una metodología útil para determinar la relación fluoróforo:nanopartícula tras la preparación y purificación de las nanopartículas funcionalizadas, vía ultrafiltración y electroforesis en gel, la combinación de UV-vis e ICP-MS permitió cuantificar la estequiometría fluoróforo:nanopartícula.
3. Determinación de la eficiencia de bioconjugación de QDs a anticuerpos.
En este objetivo, se abordó el estudio del potencial de la técnica híbrida AF4-ICP-MS para llevar a cabo la determinación de la eficiencia de la reacción de bioconjugación de QDs a elementos de reconocimiento (concretamente se seleccionó un anticuerpo IgG como biomolécula modelo). Es preciso optimizar la separación de los productos de la bioconjugación (exceso de reactivos y bioconjugado) para poder identificarlos a través de la medida de relaciones elementales de las especies separadas por el AF4. Las medidas precisas de relaciones elementales en cada pico del fractograma resultante permite identificar y determinar la eficiencia del proceso de bioconjugación QDs:Biomolécula.
4. Síntesis y empleo de QDs enriquecidos isotópicamente, para la determinación precisa de la estequiometría QDs:biomolécula.
En este objetivo se aborda la síntesis y caracterización de QDs isotópicamente enriquecidos para llevar a cabo la determinación de la estequiometría de la bioconjugación de biomoléculas a QDs. La síntesis y completa caracterización de los QDs isotópicamente enriquecidos (tamaño, propiedades ópticas, composición elemental etc.) hace que la determinación de la estequiometría sea posible a través de la medida de relaciones isotópicas eliminando la necesidad de la realización de un calibrado metodológico. La metodología desarrollada se evaluó para llevar a cabo la determinación de la estequiometría de los bioconjugados de QDs a diferentes biomoléculas de interés bioquímico como biotina y albúmina de suero bovino (BSA).
