Enhancing B and T cell immune responses against the HIV-1 envelope using protein and poxvirus based vaccines
- Autores: Suresh Chithathur Raman
- Directores de la Tesis: Mariano Esteban Rodríguez (dir. tes.), Manuel Fresno Escudero (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2018
- Idioma: inglés
- Número de páginas: 126
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
- Resumen
El objetivo del proyecto ha estado dirigido a establecer procedimientos de inmunización en el modelo de ratón incorporando una serie de inmunógenos que fueran capaces de inducir respuestas inmunes tanto humorales (anticuerpos) como celulares (linfocitos T CD8+, Tfh y células B de centros germinales) con capacidad potencial para controlar la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1).
La novedad del proyecto radica en la generación de una proteína de fusión compuesta por la glicoproteína GP120 del VIH-1 subtipo C (el subtipo más prevalente) fusionada en su extremo C-terminal con la proteína 14K (gen A27L) del virus vaccinia; el diseño se centra en mejorar la eficacia del antígeno GP120C mediante su oligomerización mediada por la sección de la proteína 14K. Las mejoras en la respuesta inmune obtenidas por la fusión de antígenos heterólogos con la proteína 14K del virus vaccinia, han sido previamente demostradas por el laboratorio del Dr. Esteban en el modelo de Malaria mediante la fusión de la proteína 14K a la proteína CS (circumsporozoito) de Plasmodium falciparum.
En el proyecto de Tesis se propuso generar tres tipos diferentes de inmunógenos: proteína purificada GP120C14K, vector de DNA expresando la proteína de fusión y vector viral MVA expresando la proteína de fusión. Al mismo tiempo se generaron vectores equivalentes pero expresando la proteína GP120C como control para los análisis estructurales, funcionales e inmunológicos.
Se ha realizado el diseño de las diferentes proteínas y la generación de líneas celulares CHO transfectadas de forma estable para la producción constitutiva de la proteína de fusión GP120C14K o de la proteína monomérica GP120C; ambas proteínas se han purificado mediante columnas de afinidad de lectina y cromatografía de exclusión por tamaño. Asímismo, se ha llevado a cabo la caracterización estructural, el análisis bioquímico y biofísico, microscopía electrónica y difracción de rayos X (en proceso).
Se ha generado el vector recombinante basado en el virus modificado de Ankara (MVA) expresando el antígeno GP120C14K siguiendo los protocolos estándar de recombinación homóloga. El virus MVA-GP120C14K resultante se ha caracterizado in vitro, habiéndose evaluado su capacidad de crecimiento, la estabilidad del antígeno heterólogo y la calidad/ cantidad del antígeno expresado comparándolo con el virus control MVA-GP120C.
Una vez generadas y caracterizadas las diferentes construcciones, se ha llevado a cabo la última parte del proyecto centrada en la evaluación inmunológica de estos vectores en el contexto de un protocolo de vacunación “prime-boost” en el modelo de ratón.
Se han realizado dos ensayos en el modelo de ratón orientados hacia el estudio del aumento potencial de la respuesta de células B y T en ratón por parte del antígeno GP120C14K comparado con el control monomérico GP120C mediante tres procedimientos de inmunización “prime-boost”: 1) proteína-proteína; 2) vector MVA-proteína; 3) combinación vector DNA vector MVA-proteína.
Los ensayos de inmunogenicidad se han realizado a partir de los esplenocitos, de las células de los nódulos linfáticos drenantes y del suero de los ratones inmunizados con los diferentes protocolos de vacunación. Se ha medido la expresión de citoquinas relevantes en el contexto de la inducción de una respuesta celular específica, la magnitud y fenotipo de las células B específicas, las células B de centros germinales específicos y las células Tfh o “T follicular helper” en el contexto de la vacunación frente a la Envuelta de VIH-1 y la presencia de anticuerpos frente a GP120C en las muestras de suero.
Los resultados obtenidos demuestran que la proteína de fusión GP120C14K forma oligómeros en forma de hexámeros y que éstos son solubles y superiores a la forma monomerica de GP120C en su capacidad para inducir respuestas inmunes humorales y celulares frente al VIH. Se ha valorado que los protocolos basados en la combinación de MVA/proteína y DNA/ MVA/proteína confieren una mayor ventaja inmunogénica para la proteína de fusión sobre la no fusionada y se ha propuesto un modelo de acción inmune frente al VIH-1.
