Resumen de Arquitectura y ensamblaje del relaxosoma en el plásmido conjugativo r388
El relaxosoma es el complejo nucleoproteíco necesario para un efectivo procesamiento del DNA en la conjugaciónbacteriana, presentándose en esta memoria de Tesis doctoral un estudio de los componentes del relaxosoma del plásmido R388, de la proteína acopladora TrwB y de la interacción entre ambos.
En primer lugar se estudiaron las proteínas componentes del relaxosoma de R388 comenzando por la proteína accesoria TrwA. A partir de la construcción de un plásmido sobreproductor de TrwA se purificó para su estudio bioquímico, comprbándose su unió a dos sitios (sbaA y sbaB) en el oriT de R388 que activa la actividad de corte de RrwC y reprime la transcripción del operón trwABC. Un posterior análisis por medio de mutantes sirvió para la determianción de los aminoácidos de TrwA implicados en el reconocimiento de secuencias específicas en el orT.
A continuación y para determinar cual era el sitio de uniónde TrwC al oriT se realizaron ensayos de footprinting de DNA con DMS y, por medio del tratamiento conpermanganato, se estudió la modificaicón sufrida por el DNA al unirse TrwC. Estos estudios de footprinting se realizaron también en presencia de otras proteínas como TrwA o IHF tanto en vitro como in vivo.
Además, a pesar de nohaberse observado ningún efecto in vivo de IHF sobre la conjugación de R388, se comprobó que IHF se unían al oriT de R388, como sugería la presencia de una secuencia consenso para dicha unión. Además, se estudiaron las posibles implicaciones de esa unión.
Por otro lado, la obtención por nuestro grupo de una proteína con la parte soluble de TrwB (TrwBAN70) facilitaba en gran medida su purificación y estudio. Partiendo de esta proteína y de la porteína mutante TrwB(K136T)AN70 se estudió la unión a ATP y su hidrólisis, la unión a DNA y la unión a otras proteínas. Estos datos nos dieron una idea de cómo es la interacción de TrwB con el relaxosoma. Además la proteína TrwBAN
