Caracterización de las subunidades de unión a nucleótido del transportador ABC de nitrato/nitrito de la cianobacteria phormidium laminosum

• Autores: Marta Llarena
• Directores de la Tesis: Juan Luis Serra Ferrer (dir. tes.), María Jesús Llama Fontal (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad del País Vasco - Euskal Herriko Unibertsitatea ( España ) en 2005
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: José María Vega Piqueres (presid.), Alberto Muñoz Rueda (secret.), Emilio Fernandez Reyes (voc.), María José Bonete Pérez (voc.), Francisco Javier Florencio Bellido (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Enzimología
      • Biología molecular
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
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• Resumen

  • En cianobacterias el nitrato/nitrito se transportan al inferior celular mediante un transportador "ATP-binding cassette" (ABC) denominado NRT, compuesto por cuatro subunidades proteicas: NrtA (subunidad periplásmica responsable de la unión del nitrato/nitrito), NrtB (subunidad transmembranal), NrtC y NrtD (subunidades de unión a nucleótido). En la cianobacteria filamentosa, termófila y no fijadora de nitrógeno, Phormidium laminosum se habían identificado los genes nrtA, nrtB y nrtC, que codifican el transportador ABC de nitrato/nitrito, formado parte del operón nir, junto con el gen mirA, que codifica la nitrito reductasa.

    En este trabajo se ha identificado el gen nrtD, a continuación de mrtC, formando parte del operón nir. La subunidad NrtC del transportador de nitrato/nitrito de P.laminosum se ha purificado a partir de células deficientes en nitrógeno y se ha comprobado que hidroliza ATP in vitro, en ausencia del resto de componentes del transportador. Los genes nrtC y nrtD se han clonado en plásmidos de expresión pQE-9 y se han expresado en E.coli, purificándose como proteínas de fusión a cola de histidinas. Se han caracterizado las subunidades His6NrtC e His6NrtD por su capacidad para catalizar la hidrólisis de ATP, con respecto a su especificidad por varios sustratos y sensibilidad a inhibidores, demostrándose la que ambas proteínas hidrolizan ATP in vitro.

    Además, mediante elctroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes se ha detectado la formación de homodímeros de NrtC, His6NrtC e His6NrtD. La formación de homodímeros de His6NrtD también se ha comprobado por espectrometría de masas MALDI-TOF.