Identification of P. aeruginosa binding molecules for complement component C3 and surfactant protein A

• Autores: Mohammad Ahmad Mohammad Qadi
• Directores de la Tesis: Sebastián Albertí Serrano (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de les Illes Balears ( España ) en 2017
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Jordi Vila Estapé (presid.), Antonio Oliver Palomo (secret.), Rafael Cantón Moreno (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Microbiología Ambiental y Biomédica por la Universidad de las Illes Balears
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Microbiología
  • Ciencias agrarias
    • Fitopatología
      • Bacterias
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: RepositoriUIB
• Resumen
  • español

    Pseudomonas aeruginosa es uno de los principales patógenos causantes de neumonía nosocomial grave y sepsis. Las proteínas surfactantes y el sistema del complemento juegan un papel crítico en la defensa del huésped frente a las infecciones por P. aeruginosa. Sin embargo, las dianas bacterianas de la proteína surfactante A (PS-A), la principal proteína surfactante del pulmón, y de C3, el componente central del sistema del complemento, no han sido investigadas adecuadamente. Los objetivos de este estudio fueron: i) caracterizar la interacción entre la PS-A y una colección de aislados crónicos isogénicos de pacientes con fibrosis quística (FQ) para identificar las moléculas de unión de la PS-A en P. aeruginosa y el mecanismo adoptado por estos aislados para resistir la muerte mediada por la PS-A e ii) identificar nuevas moléculas de P. aeruginosa que unen C3, así como también caracterizar las estrategias que este patógeno utiliza para evadir los efectos del sistema del complemento.

    Contenido de la investigación: Para alcanzar el primer objetivo, se utilizó una combinación de distintas aproximaciones metodológicas in vitro incluyendo ensayos de unión con PS-A humana purificada, análisis de espectrometría de masas, pérdida genética de función / ganancia de función de genes bacterianos seleccionados y ensayos de fagocitosis con macrófagos humanos. Se caracterizó la interacción entre la PS-A y una colección de aislamientos secuenciales isogénicos de siete pacientes con FQ. Se identificó la proteína de membrana externa OprH como un nuevo ligando de PS-A en P. aeruginosa. Los aislados tardíos unieron significativamente menos PS-A que los aislamientos isogénicos tempranos, respectivos. Esta diferencia pudo asociarse a una reducción en la expresión de OprH. La unión de PS-A a OprH facilitó la eliminación de P. aeruginosa por fagocitosis.

    De esta forma, los aislados tardíos fueron al menos dos veces más resistentes a la eliminación por fagocitosis mediada por PS-A que sus aislados tempranos respectivos. La identificación de nuevas moléculas de P. aeruginosa que unen C3 surgió como resultado de un estudio diseñado para investigar el papel de PhoQ en las bacteremias causadas por P. aeruginosa. Se observó que un mutante deficiente en PhoQ era avirulento en un modelo murino de infección sistémica y no causaba bacteriemia. En presencia de concentraciones sanguíneas de Mg2+, el mutante en PhoQ unió más C3 y fue más susceptible a la opsonofagocitosis mediada por el complemento que la cepa parental, lo que sugería un efecto directo del Mg2+ sobre la modulación de la expresión de un componente bacteriano por el sistema PhoP/PhoQ. Los experimentos de unión a C3 y los ensayos de opsonofagocitosis identificaron a este componente como la proteína de membrana externa OprH.

    Conclusión: OprH es una nueva diana para la unión de PS-A en los aislados de P. aeruginosa de pacientes con FQ. La reducción de la expresión de OprH es una adaptación, previamente desconocida, que P. aeruginosa adopta en el pulmón con FQ para evadir la eliminación por la fagocitosis mediada por la PS-A. Hemos identificado a PhoQ como un sensor de Mg2+ esencial para que P. aeruginosa evite la opsonofagocitosis mediada por el complemento debido al control directo que ejerce sobre la expresión de OprH, una diana de C3, previamente desconocida, en P.

    aeruginosa.

  • English

    Introduction: Pseudomonas aeruginosa is a major opportunistic pathogen and a leading cause of severe nosocomial pneumonia and sepsis. Surfactant proteins and the complement system play a critical role in the host defense against P. aeruginosa infections. Nevertheless, the bacterial targets of the surfactant protein A (SP-A), the major surfactant protein in the lung, and the component C3, the central component of the complement system, remain poorly investigated. The objectives of this study were; i) to characterize the interaction between SP-A and a collection of chronic isogenic sequential isolates from cystic fibrosis (CF) patients to identify the SP-A-binding molecules of P. aeruginosa and the mechanism adopted by these isolates to resist the SP-A mediated clearance and ii) to identify novel C3 binding molecules of P. aeruginosa as well as to characterize new strategies that this pathogen uses to elude the complement system effects.

    Research content: To achieve the first objective, we used a combination of in vitro approaches, including binding assays with human purified SP-A, mass spectrometry analysis, genetic loss of function/gain of function of selected bacterial genes and phagocytosis assays with human macrophages. We characterized the interplay between SP-A and a collection of isogenic sequential isolates from seven CF patients. We identified outer membrane protein OprH as a novel ligand for SPA on P. aeruginosa. Late isolates from CF patients bound significantly less SP-A than their respective early isolates. This difference could be associated with a reduction in the expression of OprH. Binding of SP-A to OprH promoted phagocytic killing, thus late isolates from CF patients were at least two-fold more resistant to SP-A mediated killing by human macrophages than their respective early isolates.

    Our second objective, the identification of novel P. aeruginosa C3 binding molecules, arose from a study originally designed to investigate the role of PhoQ in P. aeruginosa bloodstream infections. We observed that a PhoQ-deficient mutant was avirulent in a murine model of systemic infection and did not cause bacteremia. In the presence of blood concentrations of Mg2+, a PhoQ mutant bound more C3 and was more susceptible to complement-mediated opsonophagocytosis than the parent strain, suggesting a direct effect of the Mg2+ on the modulation of expression of a bacterial component by the PhoP/PhoQ system. Ligand blot analysis, C3 binding experiments and opsonophagocytosis assays identified this component as the outer membrane protein OprH.

    Conclusion: We have shown that OprH is a novel P. aeruginosa SP-A-acceptor molecule on CF isolates. We postulate that reduction of OprH expression is a previously unrecognized adaptation of P.

    aeruginosa to CF lung that facilitates the escape of the microorganism from the SP-A-mediated phagocytic killing. Moreover, this study identifies PhoQ as an essential Mg2+ sensor for P. aeruginosa to avoid complement-mediated opsonophagocytosis due to the direct control that exerts on the expression of OprH, a previously unrecognized C3 binding molecule of P. aeruginosa.

  • català

    Introducció: Pseudomonas aeruginosa és un dels principals patògens causants de pneumònia nosocomial greu i sèpsia. Les proteïnes surfactants i el sistema del complement juguen un paper crític en la defensa de l'hoste enfront de les infeccions per P. aeruginosa. Malgrat això, les dianes bacterianes de la proteïna surfactant A (PS-A), la principal proteïna surfactant del pulmó, i de C3, el component central del sistema del complement, no s'han investigat adequadament. Els objectius d'aquest estudi van ser: i) caracteritzar la interacció entre la PS-A i una col·lecció d'aïllats crònics isogènics de pacients amb fibrosis quística (FQ) per identificar les molècules d'unió de PS-A a P. aeruginosa i el mecanisme adoptat per aquests aïllats per resistir la mort mediada per la PS-A i ii) identificar noves molècules de P. aeruginosa que uneixen C3, així com caracteritzar les estratègies que aquest patogen utilitza per evadir els efectes del sistema del complement.

    Contingut de la recerca: Per aconseguir el primer objectiu, es va utilitzar una combinació de diferents aproximacions metodològiques in vitro incloent assajos d'unió amb PS-A humana purificada, anàlisi d'espectrometria de masses, pèrdua genètica de funció / guany de funció de gens bacterians seleccionats i assajos de fagocitosis amb macròfags humans. Es va caracteritzar la interacció entre la PS-A i una col·lecció d'aïllaments seqüencials isogènics de set pacients amb FQ. Es va identificar la proteïna de membrana externa OprH com un nou lligant de la PS-A a P. aeruginosa. Els aïllats finals van unir significativament menys PS-A que els aïllaments isogènics inicials, respectius. Aquesta diferència va poder associar-se a una reducció en l'expressió de OprH. La unió de PS-A a OprH va facilitar l'eliminació per fagocitosi de P. aeruginosa. D'aquesta forma, els aïllats finals van ser almenys dues vegades més resistents a l'eliminació per fagocitosi mediada per la PS-A que els aïllats originals respectius. La identificació de noves molècules de P. aeruginosa que uneixen C3 va sorgir com a resultat d'un estudi originalment dissenyat per investigar el paper de PhoQ en les bacteremias causades per P. aeruginosa. Es va observar que un mutant deficient en PhoQ era avirulent en un model murí d'infecció sistémica i no causava bacteriemia. En presència de concentracions sanguínies de Mg2+, el mutant de PhoQ va unir més C3 i va ser més susceptible a l'opsonofagocitosis mediada pel complement que la soca parental, la qual cosa suggeria un efecte directe del Mg2+ sobre la modulació de l'expressió d'un component bacterià pel sistema PhoP/PhoQ. Els experiments d'unió de C3 i els assajos d'opsonofagocitosis van identificar a aquest component com la proteïna de membrana externa OprH.

    Conclusió: OprH és una nova diana per a la unió de PS-A en els aïllats de P. aeruginosa de pacients amb FQ. La reducció de l'expressió de OprH és una adaptació, prèviament desconeguda, que P. aeruginosa adopta en el pulmó amb FQ per evadir l'eliminació per la fagocitosi mediada per la PS-A. Hem identificat a PhoQ com un sensor de Mg2+ essencial per a que P. aeruginosa eviti l'opsonofagocitosis mediada pel complement a causa del control directe que exerceix sobre l'expressió de OprH, una diana de C3, prèviament desconeguda, en P. aeruginosa.