Contribution of DNA polymerase epsilon exonuclease activity to replication fork collapse

• Autores: Grazia Pellicanò
• Directores de la Tesis: Rodrigo Bermejo Moreno (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2018
• Idioma: inglés
• Número de páginas: 97
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen
  • español

    En el presente trabajo hemos descubierto y caracterizado una contribución deletérea de la actividad exonucleasica de la polimerasa de ADN ε en el proceso de colapso de la horquilla de replicación. Células incapaces de activar la respuesta del checkpoint de replicación y deficientes para la actividad exonucleasa de Pol ε y Exo1 son capaces de sobrevivir al estrés replicativo y completar la replicación del genoma. Estas observaciones sugieren que la resección de las hebras nacientes, la adelantada por parte de Pol ε, y la rezagada por parte de Exo1, provoca el colapso de la horquilla.

    Contrariamente, la actividad exonucleasa de Pol δ parece no tener una contribución relevante en el colapso de la horquilla.

    Ha sido propuesto que el checkpoint de replicación promueve la estabilidad de la horquilla fosforilando directamente factores constituyentes del replisoma. Hemos, por lo tanto, encontrado, A través de un análisis de fosforilación, las subunidades de Pol ε Pol2 y Dpb2 fosforiladas de manera dependiente del checkpoint. Un análisis de espectrometría de masas identificó ciertas serinas de Pol2 y Dpb2 fosforiladas en células que experimentan estrés replicativo, las cuales se ajustan al motivo consenso de las dianas de Rad53. pol2-S430D, un alelo de POL2 que exprese una proteína Pol2 que mimetiza la fosforilación de la serina 430, suprime la sensibilidad a HU de células deficientes en el checkpoint en combinación con la delección de EXO1, sugiriendo que su fosforilación podría contrarrestar la resección de la hebra naciente líder por parte de Pol ε. En la estructura cristalina de Pol2, la serina 430 se encuentra en el trayecto que la cadena naciente de ADN debe recorrer para translocarse desde el sitio polimerasico hasta el sitio exonucleasico. En base a estos resultados, proponemos que la fosforilación de la serina 430 de Pol2, mediada por el checkpoint, podría impedir la translocación desde el sitio catalítico polimerasico al sitio exonucleasico, limitando la resección de la cadena naciente líder por parte de Pol ε.

    Este mecanismo, junto con la inhibición de Exo1, también mediada por el checkpoint, protegería ambas cadenas nacientes de la resección cuando la horquilla se ve detenida preservando así la integridad y la estabilidad de la horquilla.

  • English

    In the present work we discovered and characterized a deleterious contribution of DNA polymerase ε exonuclease activity to the collapse of replication forks. We found that checkpoint deficient cells lacking exonuclease activities of both Pol ε and the Exo1 proteins are able to survive replication stress induced by nucleotide pools depletion and manage to complete bulk genome replication in these conditions.

    These observations suggest that nucleolytic resection of leading and lagging nascent strands by Pol ε and Exo1, respectively, drives fork collapse. Conversely, the exonuclease activity of Pol δ does not seem to have a major contribution in fork collapse.

    It was proposed that checkpoint kinases promote fork stability by directly phosphorylating replisome factors. We thus performed a phosphorylation screen for proteins belonging to Pol ε and Pol δ holoenzymes, in order to explore whether their function might be regulated by the checkpoint response. We found that the Pol2 and Dpb2 Pol ε subunits are phosphorylated in Mec1- and Rad53-dependent manner.

    Mass spectrometric analysis identified serines in Pol2 and Dpb2 that are phosphorylated in cells experiencing replication stress, some of which fitted the Rad53 target motif. We found that, similarly to POL2 exonuclease deficient mutations, a pol2- S430D allele, expressing a phosphomimicking Pol2 variant restored checkpoint deficient cells viability in HU when combined with the deletion of EXO1, suggesting phosphorylation of S430D might counteract leading nascent strand resection by Pol ε.

    In the crystal structure of Pol2, S430 lies in the path that the primer DNA travels to switch from the polymerase to the exonulease sites, suggesting that its phosphorylation may preclude access of nascent strands to the latter. Based on these results, we propose that checkpoint-mediated phosphorylation of Pol2 serine 430 might preclude partitioning between polymerase and exonuclease sites, limiting the resection of leading nascent strands by stalled Pol ε. This mechanism, along with the inhibition of Exo1 also mediated by checkpoint-mediated phosphorylation, would protect both leading and lagging strands from resection upon fork stalling and preserve the functional integrity of replication forks.