Efecto de los agonistas del receptor de trombopoyetina en la hemostasia de los pacientes con trombocitopenia inmune primaria
- Autores: Raúl Justo Sanz
- Directores de la Tesis: Nora Butta Coll (dir. tes.), Teresa María Alvarez Román (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Número de páginas: 286
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Medicina y Cirugía por la Universidad Autónoma de Madrid
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
- Resumen
ANTECEDENTES La trombocitopenia inmune primaria (PTI) es un trastorno autoinmune que se caracteriza por un recuento de plaquetas bajo y aislado (recuento inferior a 100×109 plaquetas/L) con grandes variaciones en el número, en la actividad de las plaquetas así como en su manifestación clínica. La etiopatogenia de la PTI incluye desde una reducción de la supervivencia plaquetaria debido a su destrucción periférica y una megacariopoyesis ineficaz con disminución de la producción de megacariocitos (MKs) y plaquetas, hasta una disregulación del sistema inmune que puede llegar a desencadenar hemorragias en los pacientes que la padecen.
Los pacientes con PTI se caracterizan por tener una alteración en la hemostasia primaria, desencadenando sangrado mucocutáneo, petequias, equimosis y bullas hemorrágicas en mucosas (fundamentalmente en la cavidad oral). En la mayoría de los casos la clínica de la PTI es leve, siendo las hemorragias intracraneales y gastrointestinales las más graves, pero también las menos frecuentes. Dado que muchos pacientes presentan un fenotipo hemorrágico leve a pesar del bajo recuento plaquetario, los beneficios y los riesgos asociados a los tratamientos deben considerarse con precaución, ya que algunas alternativas terapéuticas como son los agonistas del receptor de trombopoyetina (AR-TPO) podrían suponer un riesgo trombótico adicional al estado del paciente, más si cabe el paciente ha sido sometido previamente a esplenectomía.
HIPÓTESIS La escasa sintomatología hemorrágica que suelen presentar los pacientes con PTI hace pensar que podrían contar con algún mecanismo procoagulante compensatorio que disminuya el riesgo y la gravedad del sangrado causado por la trombocitopenia.
OBJETIVOS El objetivo principal de esta propuesta es caracterizar la hemostasia de los pacientes con PTI, identificar los posibles mecanismos procoagulantes compensatorios de la trombocitopenia y evaluar el efecto del tratamiento con los AR-TPO sobre los mismos. Para ello, en este estudio tratamos de: 1- Caracterizar la hemostasia en pacientes con PTI determinando las características funcionales de las plaquetas circulantes, la cinética de la generación de trombina y de la formación del coágulo. 2- Evaluar los mecanismos procoagulantes que podrían estar estimulados en los pacientes con PTI, entre los que se encuentra: el nivel de expresión de los receptores de adhesión en la superficie plaquetaria y su capacidad de activación tras la estimulación con agonistas; la capacidad de exposición de fosfatidilserina (PS) en la superficie plaquetaria y anclaje del complejo protrombinasa; generación de micropartículas (MPs) celulares y su capacidad trombogénica; y la actividad del sistema fibrinolítico. 3- Determinar el efecto de los AR-TPO sobre los mecanismos previamente mencionados.
MÉTODOS Se reclutaron un total de 82 pacientes con PTI primaria crónica según los criterios definidos por Rodeghiero et al (2009), desde septiembre de 2015 hasta diciembre de 2017 en la Sección de Hemostasia del Servicio de Hematología del Hospital Universitario la Paz. Cuarenta pacientes estaban sin tratamiento desde al menos seis meses antes de realizar el estudio (78% mujeres, edad media de 51,7±20,1 años) y otros cuarenta y dos tratados con los AR-TPO durante al menos dos meses antes de realizar el estudio (53% mujeres, edad media de 64,9±17,4 años). Ciento doce sujetos sanos (55% mujeres, edad media 57±25 años) reclutados en la Sección de Donantes del Servicio de Hematología y Hemoterapia del Hospital Universitario La Paz también fueron incluidos en el estudio. Se utilizó la citometría de flujo (CMF) para estudiar la función plaquetaria, cuantificar las plaquetas inmaduras, actividad de las caspasas 3/7, 8 y 9 de las plaquetas, exposición de PS y anclaje del complejo protrombinasa a la superficie plaquetaria así como para analizar el patrón de unión de diferentes lectinas a las glicoproteínas (GPs) de la superficie plaquetaria.
Para estudiar de forma global la cinética de formación del coágulo y la fibrinolisis se utilizó la tromboelastometría rotacional (ROTEM®). Para determinar la capacidad procoagulante del plasma se usó un test de generación de trombina, concretamente la trombinografía calibrada automatizada o CAT® (Calibrated Automated Thrombogram, Thrombinoscope®). La capacidad procoagulante asociada a MPs se determinó mediante un método cromogénico utilizando los kits de MP-Activity y MP-FT-Activity de ZYMUPHEN®. Tanto la determinación de los niveles plasmáticos de TPO, los de t-PA y u-PA así como la actividad de TAFI se realizaron mediante la técnica de ELISA.
RESULTADOS Los pacientes con PTI tenían menor número de plaquetas que los individuos sanos, no observándose diferencias entre ambos grupos de pacientes con PTI. El número de plaquetas inmaduras fue más alto en los pacientes con PTI que en los controles, lo que se traduce en una médula ósea que trata de compensar la aumentada destrucción periférica de plaquetas con un aumento de la síntesis de plaquetas que no han completado totalmente su proceso de maduración. Los niveles plasmáticos de TPO en los dos grupos de pacientes con PTI fueron mayores que en el grupo control.
Resultado del estudio de la cinética de formación del coágulo por ROTEM® en plasma rico en plaquetas (PRP) ajustado a 25.000 plaquetas, se obtuvo que la fortaleza máxima del coágulo (MCF) fue mayor en las muestras de los pacientes con PTI tratados con los AR-TPO y la lisis del coágulo a los 60 minutos fue menor que en el grupo control, destacando el perfil procoagulante de los pacientes tratados con los AR-TPO.
Para intentar justificar si el perfil procoagulante observado en el ROTEM® de los pacientes tratados con los AR-TPO podría deberse a la mayor capacidad de generar trombina del plasma o a la propia reactividad de las plaquetas de estos pacientes, se realizó el CAT® en muestras de plasma pobre en plaquetas (PPP) y se estudió la capacidad de activación plaquetaria en PRP respectivamente. En el CAT® no hubo diferencias entre los distintos grupos en el tiempo de latencia (o lagtime), pero sí un aumento en el ETP y en el pico del trombograma en los dos grupos de pacientes de PTI respecto de los controles sanos. No se encontraron diferencias entre los grupos en el estado de activación basal de las plaquetas, salvo en la mayor expresión de P-selectina en las plaquetas sin estimular de los pacientes tratados con los AR-TPO.
Por el contrario, tras la activación con TRAP las plaquetas de los pacientes con PTI sin tratamiento y tratados con los AR-TPO unieron menos PAC1 y expusieron menos Pselectina y CD63 que el grupo control.
Como los pacientes con PTI presentaban una actividad plaquetaria anómala se decidió estudiar la apoptosis en las plaquetas de estos pacientes. Las plaquetas de los pacientes con PTI tratados con los AR-TPO exponían más PS en su superficie que las plaquetas de los controles sanos. Esta PS expuesta en la superficie plaquetaria era funcional para el anclaje del complejo protrombinasa (FVaXa) debido a que la unión de este complejo se encontró aumentado en los pacientes con PTI tratados con los AR-TPO, justificando al menos en parte, el perfil procoagulante obtenido en el ROTEM® de estos pacientes. Con el objeto de evaluar si la mayor exposición de PS observada en la superficie de las plaquetas de los pacientes con PTI tratados con los AR-TPO se correspondía con una mayor apoptosis en sus plaquetas, determinamos la actividad de las caspasas 3/7, 8 y 9 por CMF y demostramos que su actividad estaba aumentada en las plaquetas de los pacientes tratados con los AR-TPO. Igualmente se obtuvo que los pacientes con PTI tratados con los AR-TPO tenían mayor capacidad trombogénica asociada a MPs que el grupo sin tratamiento y que los individuos sanos. Para determinar si el tratamiento con los AR-TPO era realmente el responsable del aumento de la apoptosis observado en las plaquetas de los individuos con PTI sometidos a ese tratamiento, estudiamos el efecto in vitro de la TPO y del romiplostim en células MEG-01 respecto a un grupo control (sin tratamiento). A las 72 horas de tratamiento la actividad de la caspasa 3 fue mayor en los grupos de MEG-01 tratados con TPO y con romiplostim respecto al grupo control. Tras una semana de tratamiento, la actividad de la caspasa 3 fue igual en todos los grupos, pero la actividad de las caspasas 8 y 9 fue mayores en los grupos tratados con TPO y con romiplostim.
Se determinaron los niveles plasmáticos de t-PA y u-PA así como la actividad de TAFI en el plasma y no hubo diferencias entre los grupos. Sin embargo, se observó un aumento en los niveles plasmáticos y en el contenido plaquetario de PAI-1 en muestras del grupo de los pacientes con PTI tratados con los AR-TPO, lo que podría justificar el perfil hipofibrinolítico de estos pacientes observado en el ROTEM®. Con el fin de determinar si el tratamiento con los AR-TPO era responsable del aumento en el contenido de PAI-1 plaquetario, se realizaron experimentos en células MEG-01 incubadas con tampón y con TPO o romiplostim. Tanto la TPO como el romiplostim aumentaron el contenido endógeno de PAI-1 en las células MEG-01.
CONCLUSIÓN -El estudio de la cinética de la formación del coágulo de los pacientes de PTI tratados con los AR-TPO mostró un perfil procoagulante en estos pacientes que se puso de manifiesto con un aumento en la máxima fortaleza del coágulo y en una disminución de la fibrinolisis.
-Este efecto no parece estar relacionado con un aumento en la capacidad de activación de las plaquetas ya que, por el contrario, las plaquetas de todos los pacientes son hiporreactivas al estímulo con agonistas. No obstante, se observó un aumento en la expresión de P-selectina en condiciones basales en la superficie de las plaquetas de estos pacientes, lo podría favorecer la interacción entre plaquetas-células blancas y podría aumentar la fortaleza del coágulo.
-Las plaquetas de los pacientes con PTI tratados con los AR-TPO mostraron más signos de apoptosis que las de los pacientes que no recibían tratamiento. Estos signos incluían un aumento en la exposición de PS y en la actividad de las caspasas 3/7, 8 y 9.
-La sobreexposición de PS aumentó la superficie disponible para la unión del complejo protrombinasa (FXaVa). Este hecho podría constituir un mecanismo procoagulante compensatorio que podría reducir el riesgo de sangrado de los pacientes con PTI.
-Los experimentos realizados en células MEG-01 sugirieron que los AR-TPO podrían tener un efecto inductor de la actividad de las caspasas de las plaquetas.
-La apoptosis aumentada de las plaquetas de los pacientes con PTI tratados con los AR-TPO podría ser la responsable de generar más MPs y, consecuentemente, de la mayor capacidad de generar trombina asociada a MPs observada en estos pacientes.
-El tratamiento con los AR-TPO de los pacientes con PTI induce un aumento de los niveles plasmáticos y plaquetarios de PAI-I, lo que podría justificar el perfil hipofibrinolítico y procoagulante observado en estos pacientes.
-La glicosilación y las características de sialinización de las plaquetas de los pacientes con PTI puede ser clave para entender la fisiopatología de la enfermedad y las diferencias en las manifestaciones clínicas de los pacientes y el efecto que podrían tener las distintas alternativas terapéuticas disponibles.
-La evaluación global de la hemostasia y el estudio de los mecanismos procoagulantes compensatorios asociados al tratamiento con los AR-TPO deberían tenerse en cuenta a la hora de decidir la conveniencia y la pauta de tratamiento a recomendar en los pacientes con PTI y no basar la decisión exclusivamente en los recuentos plaquetarios.
-Es recomendable conocer las comorbilidades asociadas al paciente con PTI y hacer una evaluación clínica cuidadosa para detectar a aquellos con estados protrombóticos (incluida la esplenectomía), que podrían tener consecuencias negativas en la calidad de vida de los pacientes con PTI. De esta forma podríamos ofrecer una medicina de precisión a estos pacientes y optimizar los tratamientos y sus costes.
