Resumen de Síntesis y estudio de sistemas piridazinónicos condensados con potencial actividad terapéutica
El trabajo de investigación realizado en esta tesis doctoral ha tenido como objetivo analizar el potencial farmacológico de sistemas piridazinónicos condensados, y en particular del núcleo de ftalazin-1(2H)-ona, frente a dos tipos de procesos patológicos asociados al envejecimiento, las enfermedades neurodegenerativas, en concreto la enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP), y el cáncer, todas ellas de elevada prevalencia en los países desarrollados.
Para ello se han diseñado y sintetizado diversas series de derivados de ftalazinona los cuales se han sometido, en función de su estructura, a distintos tipos de estudios biológicos in vitro, tales como estudios de inhibición enzimática de colinesterasas (actividad IChE) y de monoaminooxidasas (actividad IMAO), y estudios de citotoxicidad en varias líneas celulares cancerosas humanas.
Así, en primer lugar, se ha sintetizado una serie de 10 derivados de ftalazinona de estructura análoga al donepezilo (inhibidor selectivo de AChE), sustituidos o no con grupos metoxilo en el anillo bencénico, y en los que se hizo variar la longitud de la cadena lateral que une el biciclo con el fragmento de N-bencilpiperidina (n=1-3). También se realizaron modificaciones en la posición C4 de la ftalazinona, incluyendo sustituyentes de distinto tamaño, que permitiesen distintas posibilidades en la interacción con la enzima.
La síntesis de estos derivados de ftalazinona se realizó vía funcionalización del correspondiente núcleo de ftalazinona con el fragmento de N-benzilpiperidinalquilo adecuado.
Se utilizaron seis precursores con estructura de ftalazin-1(2H)-ona susceptibles de funcionalización con el fragmento N-benzilpiperidinalquilo, dos de ellos comerciales (ftalazin-1(2H)-ona y 4-p-tolilftalazin-1(2H)-ona) y cuatro obtenidos por síntesis (6-metoxiftalazin-1(2H)-ona, 7-metoxiftalazin-1(2H)-ona, 6,7-dimetoxiftalazin-1(2H)-ona y 4-metilftalazin-1(2H)-ona).
Las tres ftalazinonas que incorporan en su estructura grupos metoxilo (compuestos 16-18) fueron obtenidas utilizando como intermedios clave las isobenzofuranonas (7-9), vía bromación con NBS seguida de tratamiento con hidrazina. La 5-metoxiisobenzofuranona 7 se preparó de forma regioselectiva a partir del 4-metoxiftalato de dimetilo en una secuencia de tres etapas, que implicaron una hidrólisis seguida de deshidratación y reducción del anhídrido bicíclico así obtenido, dando lugar a la esperada lactona o isobenzofuranona, mientras que la 6-metoxiisobenzofuranona y la 5,6-dimetoxiisobenzofuranona (8 y 9) se obtuvieron en un solo paso por cloroformilación del ácido 3-metoxibenzoico (2) y del ácido 3,4-dimetoxibenzoico (3), respectivamente.
Por otra parte, la ftalazinona sustituida en C4 con un grupo metilo (19) se obtuvo por reacción directa del ácido 2-acetilbenzoico con hidrazina.
A continuación, una vez sintetizadas las ftalazinonas, se procedió a su funcionalización con el fragmento N-bencilpiperidinalquilo. Los compuestos que poseen una cadena alquílica de uno o dos átomos de carbonos (n=1, 2) entre el núcleo de ftalazinona y la piperidina se sintetizaron en tres etapas mediante alquilación de las ftalazinonas 14-19 con las 4-bromometil y 4-(2-bromoetil)-N-Boc-piperidinas (32 y 33), seguida de hidrólisis del grupo protector y posterior bencilación. Las bromoalquilpiperidinas 32 y 33 se generaron previamente a partir de los alcoholes correspondientes y mediante una bromación tipo Appel.
Por otra parte, lo derivados de ftalazinona 62 y 63 en los que n=3 se obtuvieron por reacción directa de 14 y 18 con la 1-bencil-4-(3-bromopropil)piperidina (37), obtenida a partir del 3-(piridin-4-il)propanol en tres etapas, que engloban la reducción del anillo de piridina, la bencilación del nitrógeno y la posterior transformación del alcohol en el bromoderivado.
Una vez obtenida esta serie de derivados de ftalazinona análogos del donepezilo se determinó su efecto sobre la actividad de la hAChE y la hBuChE. La mayoría de estos compuestos fueron activos frente a los dos tipos de colinesterasas, si bien, en general, resultaron selectivos frente a la hAChE. Únicamente el compuesto 58 (n=2, C4=p-Tol) se comportó como inhibidor dual (CI50 frente a hAChE = 3,45 µM y CI50 frente a BuChE = 5,50 µM).
Los datos obtenidos también indicaron que la actividad frente a la AChE es dependiente de la longitud de la cadena alquílica que une el núcleo de ftalazinona con el fragmento de N-bencilpiperidina, siendo los compuestos con n=2 los más activos de esta serie. Asimismo, también se pudo analizar la influencia de los grupos metoxilo en la actividad, siendo los compuestos que presentan dicho sustituyente en la posición C6 los IAChE más activos y selectivos (59 (CI50=0,55 µM), 61 (CI50=0,67 µM) y 63 (CI50=1,07 µM)).
Se han llevado a cabo estudios de docking que han permitido analizar el modo de unión de estos compuestos a las colinesterasas y explicar los resultados experimentales obtenidos.
Teniendo en cuenta estos resultados y con la idea analizar la importancia del anillo aromático para la actividad y de obtener más información sobre el efecto de la sustitución en C4 se planteó el estudio de un nuevo sistema bicíclico de estructura furopiridazinónica (29).
El planteamiento sintético seguido para generar la furopiridazinona 29 se ha basado en utilizar la lactona bicíclica 26 como intermedio clave, que por reacción con hidrazina, vía la hidroxifuropiridazinona 27, seguida de deshidratación y aromatización condujo al producto esperado. La lactona 26 se obtuvo a partir de furano mediante una secuencia de reacciones, entre las que se encuentra la oxidación del alquilfurano 24 con oxígeno singlete, para generar el metoxibutenólido 25, seguida de una adición de Michael intramolecular, que tiene lugar in situ tras la desprotección del éter de silicio presente en dicho butenólido.
Una vez obtenido el sistema de furopiridazinona 29 se incorporó el fragmento N-benzilpiperidinpropilo de manera análoga a las ftalazinonas anteriormente sintetizadas.
El descubrimiento de los efectos antiparkinsonianos y neuroprotectores que presentan los inhibidores de MAO-B ha potenciado la búsqueda de inhibidores selectivos de esta isoforma de la MAO. Así, teniendo en cuenta la versatilidad farmacológica del núcleo de ftalazinona y la gran variabilidad estructural detectada en inhibidores de la MAO-B, se utilizó dicho heteronúcleo como soporte estructural de una selección de fragmentos farmacofóricos para la inhibición de la MAO-B (etoxicarbonilo, arilaminocarbonilo y propargilamino).
La incorporación de los fragmentos etoxicarbonilo y arilaminocarbonilo en la posición N2 de la ftalazinona se llevó a cabo en una sola etapa. Así, las etoxicarbonilmetilftalazinonas 65 y 66 se obtuvieron vía N-alquilación con bromoacetato de etilo, mientras que las etoxicarbonilftalazinonas 67 y 68 y las arilaminocarbonilftalazinonas 69-71 se generaron mediante N-acilación con cloroformiato de etilo y con diversos fenilisocianatos, respectivamente.
Por otro lado, para la síntesis de los derivados de propargilamina (83-85) fue necesaria la preparación previa de las bromoetilftalazinonas 78-80, que se llevó a cabo mediante la alquilación del N2 de las ftlazinonas correspondientes con 1,2-dibromoetano y carbonato potásico en DMF. Una vez sintetizados estos bromoderivados, se hicieron reaccionar con N-metilpropargilamina en presencia de DIPEA y en acetonitrilo, obteniéndo así las propargilaminas deseadas.
Para la obtención del derivado 86, portador del grupo metilpropargilamino en C4, fue necesaria la bromación del metilo en C4 de la ftalazinona 20.
Además, como continuación de los estudios previos realizados en nuestro grupo de investigación y referidos a estructuras híbridas piridazinona-ditiocarbamato, que actúan como potentes y selectivos IMAO-B, se planteó la síntesis de nuevos análogos en los que el núcleo de piridazinona se reemplazó por el de ftalazinona. Se sintetizaron nuevos derivados que difieren tanto en la longitud de la cadena alquílica que une ambos fragmentos como en la localización del fragmento ditiocarbamato en el heteronúcleo (95-100 y 101-103). Estos compuestos se sintetizaron a través de una reacción multicomponente entre las bromoalquilftalazinonas 75-82, piperidina y disulfuro de carbono, en presencia de fosfato potásico y en DMF.
Los bromoderivados 75-77 se obtuvieron a partir de las correspondientes ftalazin-1(2H)-onas vía hidroximetil derivados y mediante una bromación tipo Appel. La bromoftalazinona 81 se obtuvo por bromación radicalaria de 19 con NBS y la bromoftalazinona 82 se generó por reacción directa del ácido 2-acetilbenzoico con metilhidrazina seguida de bromación con NBS.
Se ha realizado un estudio preliminar de actividad IMAO-B de las distintas series de derivados ftalazinónicos sintetizados, N-etoxicarbonilftalazinonas y N-etoxicarbonilmetilftalazinonas (65-68), arilaminocarbonilftalazinonas (69-71), propargilaminoalquilftalazinonas (83-86) y compuestos híbridos ftalazinona-ditiocarbamato (95-103). Los datos de este cribado preliminar indican que la mayoría los compuestos estudiados inhiben la actividad de la MAO-B de forma dependiente de la concentración, pero resultan poco activos. Únicamente las arilaminocarbonilftalazinonas (69-71) y los compuestos de estructura híbrida ftalazinona-ditiocarbamato 95 y 101, presentaron porcentajes de inhibición de la actividad MAO-B superiores al 50%, siendo los compuestos 70 (% inhibición MAO-B a 100 µM=90%) y 101 (% inhibición MAO-B a 100 µM=75,74%) los más prometedores.
Asimismo, los buenos resultados de citotoxicidad, en líneas celulares cancerosas humanas, descritos también previamente para los compuestos de estructura híbrida piridazinona-ditiocarbamato, promovieron la realización de un estudio similar con los derivados ftalazinónicos 95-100 y 101-103, así como la síntesis de nuevos derivados análogos a la brasinina, en los que la ftalazinona sustituye al núcleo de indol (112-132 y 133-139).
Para acceder estas nuevas series de compuestos fue necesaria la transformación previa de las bromoalquilftalazinonas 78-80 y 82 en las correspondientes aminoalquilftalazinonas 108-111. Ésta se llevó a cabo adaptando metodologías basadas en la síntesis de Gabriel. La transformación de las aminoftalazinonas 108-111 en los ditiocarbamatos 112-132 y 133-139 se realizó mediante la reacción multicomponente antes mencionada, utilizando disulfuro de carbono y distintos bromuros de alquilo, en presencia de fosfato potásico y en DMF.
Se realizaron estudios in vitro de inhibición de la proliferación celular, frente a tres líneas celulares cancerosas humanas, cáncer de ovario (A-2780), cáncer de pulmón (NCI-H460) y cáncer de mama (MCF-7), de las cuatro series de ditiocarbamatos (95-100, 101-103, 112-132 y 133-139).
Los resultados correspondientes a las dos primeras series de compuestos híbridos (95-100 y 101-103) indican que la inclusión del fragmento ditiocarbamato en la posición C4 resulta más beneficiosa para la actividad que la inclusión del mismo en N2. Además, la actividad de los análogos portadores del fragmento ditiocarbamato en C4 también parece estar influenciada por el tipo de sustituyente en N2, siendo el derivado sustituido en N2 con un grupo metilo (102) el más prometedor, ya que resultó muy activo en dos de las tres líneas celulares estudiadas (A-2780, CI50=2,45 µM, NCI-H460, CI50=2,45 µM), con una potencia superior al análogo piridazinónico previamente estudiado (A-2780, CI50=20 µM, NCI-H460, CI50=23 µM), en ambas líneas celulares, y al cisplatino(CI50=5,54 µM), en la línea celular NCI-H460.
En cuanto a las dos series de derivados de ftalazinona análogos de la brasinina (112-132 y 133-139), cabe resaltar que también se observaron diferencias importantes en la actividad en función de la posición del fragmento ditiocarbamato.
Así por ejemplo, todos los compuestos portadores del fragmento ditiocarbamato en N2 (112-132) resultaron activos frente a la línea celular A-2780 (cáncer de ovario), la mayoría de ellos también resultaron activos frente a la línea MCF-7 (cáncer de mama) y solo uno (132) frente a la línea NCI-H460 (cáncer de pulmón), siendo los más interesantes aquellos que presentan un grupo bromobencilo o un grupo propargilo unido al azufre, y en particular los compuestos 118 y 130, ambos carentes de sustituyente en C4. Los compuestos 118 y 130 resultaron equipotentes frente a la línea celular A-2780 (CI50=5,53 µM y 5,20 µM) y menos activos que el cisplatino (CI50=0,54 µM). Sin embargo, el compuesto 130 (CI50=7,64 µM) resultó más potente que el cisplatino (CI50=13 µM) en la línea celular MCF-7.
En cuanto a los análogos de brasinina portadores del fragmento ditiocarbamato en C4 del anillo de ftalazinona, todos ellos resultaron activos frente a las tres líneas celulares estudiadas. La mayoría de estos compuestos, excepto 138 y 139, resultaron más potentes frente a la línea celular NCI-H460, presentando varios de ellos valores de CI50 inferiores a 10 µM y comparables al del cisplatino (CI50=5,54 µM). También cabe destacar la actividad mostrada por el compuesto 139 frente a la línea celular A-2780 (CI50=6,75 µM), que resulta casi equipotente con el compuesto 130 (CI50=5,20 µM) y que contribuye a corroborar que la presencia del grupo propargilo favorece la actividad.
Finalmente, para la obtención de la mención de doctorado internacional se ha realizado una estancia de tres meses de duración en el Trinity Biomedical Sciences Intitute (Trinity College, Dublín), en el grupo de investigación de la Dra. Isabel Rozas. Aprovechando la experiencia que tiene este grupo en el desarrollo de derivados guanidínicos con actividad citotóxica, se ha sintetizado una serie de compuestos de estructura híbrida ftalazinona-guanidina (91-94) para su posterior estudio como agentes antineoplásicos.
