Caracterización y uso de carbohidrasas para la hidrólisis de polisacáridos no amiláceos en harinas de leguminosas, empleadas en piensos para peces, utilizando modelos de digestión in vitro
- Autores: Óscar Martínez González
- Directores de la Tesis: Manuel Díaz López (dir. tes.), Lorenzo Marquez Rodriguez (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Almería ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Silvia Martínez Llorens (presid.), María Josefa López López (secret.), Enric Gisbert (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biotecnología y Bioprocesos Industriales Aplicados a la Agroalimentación y Medioambiente por la Universidad de Almería
- Materias:
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- Resumen
La harina de pescado (FM) que tiene alto contenido de proteínas y perfil de aminoácidos favorable es preferida por el pez y cuenta con una producción mundial total de alrededor de 5-6 millones de toneladas por año, lo que representa el 4-5% de la producción total de peces de 144 millones de toneladas métricas según la FAO. A pesar de ser una importante fuente de proteínas en los piensos comerciales, la producción de harina de pescado está limitada en ciertas partes del mundo. Esta limitación provoca un encarecimiento para muchos países que practican la acuicultura y, además, la abundancia de harina de pescado, parece estar terminando. Esta situación obliga a la búsqueda de fuentes alternativas de proteína, las cuales proporcionen beneficios nutricionales similares a la harina de pescado, pero de mucho menor costo y de alta calidad.
En esta tesis, se considera mejorar el uso de proteína vegetal, específicamente la harina extraída de las semillas de lupino y soja, en la elaboración de piensos para peces como una alternativa real a sustituir parcial o totalmente la harina de pescado (FM). Para ello, consideramos las dificultades que implica el uso de esta proteína en la nutrición de peces. En el desarrollo de la presente investigación, se consideran una serie de factores antinutricionales que conlleva el uso de las proteínas de leguminosas en la digestión de los peces. En ese sentido, estimamos que uno de los principales inconvenientes para el uso de proteína de leguminosas, es el alto contenido de polisacáridos no amiláceos (NSP) que se encuentra en este tipo de harina. El uso de harina vegetal genera una problemática importante, ya que estos polisacáridos no son hidrolizables por las enzimas endógenas de los peces y acarrean una serie de anomalías digestivas y son causantes del poco aprovechamiento de esta proteína. Los experimentos se han desarrollado, con miras a resolver la problemática causada por los NSP´s con el uso de carbohidrasas exógenas. Ésta alternativa actualmente es uso común en la nutrición de otros monogástricos como aves y cerdos, pero muy poco utilizada en la acuicultura.
En vista que los peces carecen de NSPasas propias, propusimos incluir carbohidrasas exógenas en los piensos, de tal forma que realicen su función específicamente en el interior del sistema digestivo del pez. Para lograr el cumplimiento de este objetivo general, planteamos cuatro objetivos específicos, que nos permitieron comprender las diferencias estructurales del NSP de los diversos sustratos a utilizar, y además de seleccionar la enzima adecuada, optimizar la dosis por sustrato a utilizar, tamaño y especie.
El primer experimento se analizó el contenido de NSP de tres harinas de lupino (L. angustifolius, L. mutabilis y L. albus), que permitió cuantificar el contenido de NSP de cada una de las tres harinas, además de sus componentes monosacáridos (glucosa, galactosa, xilosa, arabinosa acido galacturónico) y el contenido de almidón. Este experimento nos permitió determinar la harina con mayor contenido de NSP, con el siguiente orden de mayor a menor, L. angustifolius con 373.94 g/Kg, seguido por L, albus con 294.34 g/Kg y con un menor porcentaje por L. mutabilis. 134.34 g/Kg. En las tres harinas el NSP formado por heteropolisacárido, formado por xilano celulosa, galactosa, pectina y arabinogalactano principalmente. Además, la eficacia hidrolítica de 14 productos comerciales catalogados como NSPasas, las cuales contenían actividades variadas de celulasas, xilanasas y pectinasas, además de otras enzimas consideradas como accesorias. Los productos enzimáticos que resultaron más eficaces fueron pectinasa (sigma), Ronozyme vp y Viscozyme L. Los tres productos lograron hidrolizar el 80% o más del NSP, son producidas por el hongo Aspergillus aculeatus y son identificadas principalmente como pectinasas.
El segundo experimento se caracterizaron enzimas xilanasas de tres extractos fúngicos, para entender el modo de acción de enzimas especializadas en degradar un componente variado como la hemicelulosa y que está compuesto principalmente por xilano. Se caracterizaron los extractos producidos por los hongos Scopulariopsis brevicaulis strain con código X911, Scopulariopsis flava, con código X1011 y Aspergillus versicolor strain con código CX441. Las xilanasas de los tres extractos mostraron similitudes en cuanto a sus pHs óptimos, que estuvieron en el rango de 4.5-6.0, temperaturas óptimas que fueron de 50 y 60°C. Las principales diferencias estuvieron en su capacidad xilanolítica, siendo la xilanasa del extracto CX441 y X1011 las que mostraron mayor actividad, liberando xilosa y xilobiosa como productos finales de hidrólisis, mientras que el extracto X911 que mostró menor actividad xilanasa, parece contener alta actividad xilosidasa, una enzima accesoria difícil de encontrar liberando xilosa al medio. Los extractos X1011 y CX441 mostraron gran eficiencia en la degradación del NSP de harinas extraída cereales, mientras que algunas bandas de xilanasas X911 y X1011 mostraron ser termotolerantes.
El tercer experimento consistió en caracterizar dos pectinasas, entendiendo que era determinante en la hidrólisis del NSP de lupino. Se caracterizaron las poligalacturonasas (PGasa) de los extractos enzimáticos producidos por el hongo Galactomyces geotrichum, con código 4302, y Monographella cucumerina con código 4433. Sus características bioquímicas coincidieron en cuanto a su pH óptimo de 6 y temperatura óptima de 60 °C. En este caso la PGasa del extracto 4302 mostro gran capacidad hidrolítica, sobre el ácido poligalacturónico y gran estabilidad al PH. Debido a las cualidades de estabilidad demostrada, se eligió la pectinasa 4302 para aplicarla en la hidrólisis del NSP de L. angustifolius, obteniendo resultados sobre el 90%, muy parecidos a los obtenidos con la pectinasa sigma. La PGasa 4302 libera dímeros y trímeros de ácido galacturónuco como producto de hidrolisis mientras que la PGasa de 4433 libera principalmente monómeros de ácido galacturónico. Se demostró que el reforzar la actividad pectinasa de 4302 con xilansa, contribuye a la solubilización de proteína. La PGasa del extracto 4433 mostro alta tolerancia a la temperatura, resistiendo hasta 3 horas a 100°C, por lo que se proponen nuevas aplicaciones para esta enzima.
Para el cuarto experimento, se seleccionó la enzima Viscozyme L, que demostró gran capacidad hidrolítica sobre el NSP de Lupinus, para simular la digestión gástrica de dorada, incluyendo carbohidrasas exógenas, utilizando una metodología de superficie de respuestas (MSR) y realizando un análisis multivariado. Se logró optimizar la dosis óptima para el NSP de lupino y de soja. Se obtuvieron respuestas, que describieron modelos cuadráticos relacionados con la hidrólisis del NSP y liberación de azúcares reductores y lineales, relacionados con la hidrólisis de proteínas. La harina de lupino liberó mayor cantidad de proteínas y de azúcares reductores, posiblemente relacionado con su mayor cantidad de NSP. En ambos experimentos se hidrolizó cerca del 80% del NSP y se pudo observar una mejora notable en la digestión de la proteína y liberación de aminoácidos y polipéptidos, como efecto de incluir carbohidrasa exógena. Se realizó una optimización multirrespuestas para obtener la dosis óptima de enzima para cada sustrato, considerándose las interacciones por variable, obteniéndose 12.19 FBGU/150 mg MS a 25°C. para hidrolizar el NSP de harina de lupino y 6.78 FBGU/150 mg MS a 25°C, para hidrolizar el NSP de harina de soja.
