Biotecnología industrial de microalgas marinas dinoflageladas y sustancias bioactivas derivadas
- Autores: Lorenzo López Rosales
- Directores de la Tesis: Francisco García Camacho (dir. tes.), Asterio Sánchez Mirón (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Almería ( España ) en 2016
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Fernando Camacho Rubio (presid.), Alfonso Robles Medina (secret.), Mario Tredici (voc.)
- Materias:
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- Resumen
La importancia biotecnológica de las microalgas marinas dinoflageladas como productoras de una gran variedad de sustancias bioactivas, entre las que se encuentran un gran número de biotoxinas, ha sido ampliamente reconocida en los últimos años. Básicamente, los principales sectores interesados en las biomoléculas producidas por esta división especial de las microalgas son los relacionados con la Industria Farmacéutica (macrólidos, poliéteresopolicétidos son bioactivos de interés), y la Industria Alimentaria del sector pesquero (la demanda de patrones certificados de biotoxinas no ha parado de crecer en las últimas décadas). Sin embargo, la disponibilidadde estos metabolitos es extraordinariamente escasa. Solo unas pocas toxinas son accesibles comercialmente y con precios ciertamente prohibitivos. Dada la complejidad química estructural de estas biomoléculas, su producción por síntesis química queda descartada en la mayoría de los casos. Otras posibles vías de producción como la expresión de enzimas clave implicadas en las rutas de biosíntesis (e.g. policétidosintetasa), o la clonación de genes de dinoflagelados, en otros microorganismos fáciles de cultivar están lejos de ser implementadas debido la complejidad del genoma de estas microalgas. En consecuencia, la solución más factible a medio plazo pasa por producir biomasa de dinoflagelados en fotobiorreactores (FBRs). La exigua productividad de estas sustancias bioactivas puede ser mejorada a través de la selección de especies y estirpes superproductorasy la identificación meticulosa de las condiciones óptimasde cultivo.
A pesar del reconocimiento de los dinoflagelados como factorías celulares, la explotación comercial de los innumerables metabolitos de interés descubiertos hasta ahora procedentes de los mismos es prácticamente nula. Los problemas endémicos asociados con su cultivo siguen sin resolverse después de casi 40 años. Las causas del extraordinario bajo rendimiento celular de los cultivos de dinoflagelados, en comparación con otras especies explotadas comercialmente pertenecientes a otras clases de microalgas, son muy variadas. Sin embargo, las principales apuntan a la carencia de formulaciones apropiadas de medios de cultivo, y a la extraordinaria y singular sensibilidad de los dinoflagelados, en mayor o menor grado, a las fuerzas de corte mecánicas e hidrodinámicas desarrolladas en biorreactores agitados y/o aireados. Por tanto, hasta que este problema no esté resuelto la producción masiva de microalgas dinoflageladas para la obtención de sustancias bioactivas de interés comercial seguirá siendo el principal cuello de botella para la explotación de todas estas extraordinarias moléculas.
La tesis se encuadra dentro de esta línea de trabajo y está enfocada a establecer y/o adaptar estrategias propias de la Biotecnología Industrial que permitanmejorar las perspectivas de los dinoflagelados como fuente de bioproductos de alto valor añadido. Así, se han realizado estudios de necesidades lumínicas y su influencia conjunta con la temperatura en el crecimiento y respuestas celulares; se ha trabajado en la formulación de medios de cultivo; se ha mejorado el diseño de los FBRs tipo columna de burbujeo y se han escalado las condiciones óptimas de operación hasta los 80Ly 310L de volumen de cultivo. Las especies utilizadas han sido la bentónica Prorocentrum belizeanum, productora de ácido okadaico (AO) y derivados, y las plantónicas Protoceratium reticulatum y Karlodinium veneficum, productoras de yesotoxinas (YTX) y karlotoxinas (KmTx), respectivamente.
No todas las especies citadas anteriormente han sido empleadas en cada una de las estrategias abordadas ya que las diferencias interespecíficas marcaron notablemente la velocidad de progreso en la investigación. En este sentido, los logros más importantes fueron alcanzados con K. veneficum, y en menor extensión con P. reticulatum y P. belizeanum, por este orden.
La mejora de medios de cultivo se abordó desde dos puntos de vista diferentes. El primero persiguió aprovechar el mecanismo de defensa químico desarrollado por parte de algunos dinoflagelados ante la presencia de predadores que implica la estimulación de la biosíntesis de toxinas. En este sentido, P. reticulatum (actuando como presa) fue expuesto a diversos tipos de interacción directa e indirecta con el crustáceo Artemia salina (actuando como predador). El mejor resultado se obtuvo con un medio de cultivo que contenía un 10% de sobrenadante procedente de un cultivo de A.salina en el estado larvario de nauplio. Estos resultados se escalaron razonablemente desde volúmenes de cultivo del orden de mL hasta un FBR de 15L. A esta escala se observó un aumento de la velocidad máxima de crecimiento (µmax) de un 27%, un descenso de la concentración celular máxima de un 20% y un aumento de la producción de YTX de un 50% respecto a los cultivos control sin el aditivo.
La segunda estrategia adoptada consistió en desarrollar una formulación completa del medio de cultivo para K. veneficum que mejorara la producción de biomasa y de KmTx. La técnica de optimización se basó en algoritmos genéticos (AGs). En este proceso se consiguió formular un medio basado en 25 compuestos incluyendo macronutrientes, elementos traza y vitaminas partiendo de un total de 27 nutrientes con distintos rangos de concentración. Este medio consiguió aumentar la concentración celular máxima en un 120% respecto a los cultivados con un medio inespecífico (L1). La actividad hemolítica final (medida indirecta del contenido de KmTx) de los extractos de KmTx obtenidos usando el medio de cultivo óptimo prácticamente duplicó la correspondiente a la obtenida con el medio L1.
Los datos obtenidos con K. veneficum en la optimización de un medio de cultivo, junto con datos de P. reticulatum previamente publicados por el grupo, se utilizaron en explorar la capacidad de modelización del crecimiento de dinoflagelados con redes neuronales artificiales (ANNs) para tener en cuenta el efecto de las interacciones multinutriente en medios de cultivo con un número elevado de componentes. Las ANNs están basadas en algoritmos matemáticos que simulan el modelo de aprendizaje y procesamiento de la información de las neuronas. No requieren ningún fundamento mecanístico del metabolismo celular. El modelo de ANNs utilizado fue el feed-forward back-propagation (FBN). La correlación de los datos experimentales con los predichos por la FBN fueron buenos y permitieron predecir razonablemente bien datos cinéticos obtenidos en cientos de diferentes formulaciones del medio de cultivo. Así mismo, mediante el algoritmo modificado de Garson se evaluó la significancia relativa de cada uno de los nutrientes. Microelementos y vitaminas juntos, a pesar su baja concentración en el medio, tuvieron un impacto relativo mayor que los macronutrientes. La FBN, por tanto, se han mostrado como una alternativa muy atractiva para este tipo de interacciones altamente no lineales procesos, en los que el uso de modelos mecanísticos es muy limitado.
Este estudio no es una reivindicación del uso de las ANNs frente al abordaje mecanístico. De hecho, los modelos mecanísticos son ciertamente preferibles a los modelos de caja negra como las ANNs. Estos últimos tienen ventajas sobre los primeros cuando el número de nutrientes que interactúa en el medio de cultivo es elevado. En este escenario desarrollar un modelo mecanístico y su rutina de cálculo podría ser bastante complicado e innecesario para la operación práctica de un fotobiorreactor. La decisión de usar modelos teóricos o ANNs (incluyendo sistemas expertos) depende inicialmente de la disponibilidad tanto de la teoría que explica el fenómeno como de suficientes datos para soportarla. Las ANNs son particularmente atractivas en la siguientes situaciones: (i) abundantes datos pero conocimiento teórico poco claro; (ii) datos y teoría no son adecuados; (iii) datos y teoría son abundantes, pero el modelo teórico es difícil de formular.
Se realizó una optimización de condiciones de cultivo, tanto factores ambientales como aquellos relacionados con la hidrodinámica del cultivo en FBRs. La evaluación del efecto de factores abióticos sobre el crecimiento celular y formación de bioproducto generalmente es preceptivo en cualquier estudio de cultivo. La irradiancia (I0) y la temperatura (T) son factores muy relevantes en el cultivo de microalgas fotosintéticas. Este capítulo solo recoge los resultados obtenidos con la especie bentónica P. belizeanum ya que son los publicados hasta ahora. No obstante, un estudio similar ha sido realizado con K. veneficum, cuya información ha servido para fijar valores I0 y T en capítulos posteriores.
Los experimentos con P. belizeanum se realizaron en modo discontinuo y en recipientes tipo T-flask con el objeto de conseguir cultivos ópticamente delgados y minimizar el impacto del sombreado mutuo sobre la curva velocidad de crecimiento versus irradiancia disponible. Se combinaron tres temperaturas (T = 18, 25 y 28ºC) y cuatro irradiancias (I0 = 20, 40, 80 y 120 µE•m-2•s-1). La velocidad máxima de crecimiento, µmax, de 0,204 día-1 se alcanzó a 25ºC y 40 µE•m-2•s-1. Para valores de I0 por encima de 40 µE•m-2•s-1P. belizeanum fue fotoinhibida, siendo letal a 120 µE•m-2•s-1 y 28ºC. Los cultivos sufrieron foto-inhibición independientemente de la temperatura de cultivo a valores de I0 superiores a 80 µE•m-2•s-1. Las curvas µmax-T y µmax-I0 fueron interpretadas satisfactoriamente con un modelo empírico y otro mecanístico, respectivamente. El análisis de los valores de Fv/Fm (i.e. eficiencia fotoquímica máxima del fotosistema II) y del contenido en pigmentos reveló la elevada sensibilidad a la luz de P. belizeanum, respuesta típica de especies bentónicas. El pool de los pigmentos fotoprotectores (i.e. diadinoxantina y dinoxantina) y la peridinina fueron incapaces de regular el exceso de absorción de luz aelevadas I0-T. Como cabía esperar por su condición de metabolito secundario, la síntesis de ácido okadaico (AO) estaba desacoplada de las condiciones de crecimiento óptimas; la sobreproducción de AO se dio bien a altas temperaturas, o bajo la combinación de temperaturas e irradiancias bajas. Estos resultados en condiciones indoor fueron consistentes con los obtenidos con la misma especie en un fotobiorreactor tipo bolsa bajo condiciones outdoor.
Con respecto a la optimización de condiciones de burbujeo, las estirpes de P. belizeanum y P.reticulatum utilizadas no sorportaron el contacto directo con burbujas en todo el rango de condiciones exploradas. Los mejores resultados se obtuvieron con K. veneficum. El estudio consistió en la optimización del régimen de burbujeo a través de las siguientes variables: caudal de aireación (Q), altura del cultivo (H) y el diámetro del burbujeador (d0). Los experimentos de cultivo se llevaron a cabo en un banco de columnas de burbujeo, a escala de laboratorio, cada una de ellas de 4,4 cm de diámetro interno y 2 m de altura. El proceso de optimización se realizó mediante el uso de algoritmos genéticos. Los cultivos se realizaron en modo discontinuo. Las variables de respuesta analizadas fueron concentración celular, producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), fluidez de la membrana y Fv/Fm. Las condiciones que maximizaron la velocidad de crecimiento fueron las siguientes: Q ≤ 0.26L•min-1, H ≥ 1.25m y d0 = 1.5 mm. Estas condiciones permitieron aumentar en un 60% la producción de biomasa respecto a al cultivo control. Los experimentos realizados en condiciones sub-óptimas produjeron distintos niveles de estrés celular en función del nivel de estrés de corte desarrollado en las columnas de burbujeo (algunas combinaciones de Q, H y d0 fueron letales). El estrés celular se caracterizó por un descenso de Fv/Fm, un incremento del ROS de hasta el 200% y un descenso en la fluidez de la membrana de hasta un 60%, respecto al cultivo control realizado en ausencia de burbujeo.
Los resultados comentados en la aportación del anteriores llevaron al planteamiento de un nuevo estudio para elucidar si la inhibición del crecimiento por estrés de corte se debía realmente a una cuestión de fragilidad celular o no. En este sentido se aportan nuevos aspectos sobre la sensibilidad de los dinoflagelados al estrés hidrodinámico. El campo de velocidades de disipación de energía (EDR, energy dissipation rates) observado en cultivos desarrollados en FBRs agitados neumáticamente presenta una distribución bastante heterogénea, de varios órdenes de magnitud en función del tamaño del FBR. El cálculo de EDRs promedio, bien a partir de ecuaciones macroscópicas o de valores de EDR locales estimados con CFD (i.e. Computational Fluid Dynamics), en muchas ocasiones proporciona valores aparentemente no inhibitorios que sin embargo no justifica el crecimiento celular observado. Esta discrepancia es debida a que no se suele tener en cuenta la exposición de las células a los valores locales de EDR elevados (e.g. aquellos que se dan en la superficie donde rompen las burbujas). De modo que se utilizó un dispositivo de contracción del flujo de microfluidos para evaluar la resistencia de los dinoflagelados P. reticulatum y K. veneficum a fuerzas hidrodinámicas intensas durante tiempos de exposición por debajo de 0.3 s. La caracterización del flujo y la distribución de EDR en el dispositivo se realizaron con CFD. Las células de dinoflagelados conservaron la integridad celular incluso a niveles promedio de EDR del orden de 1012W•m-3, valores mucho mayores de los que se pueden encontrar en cualquier dispositivo de cultivo. Por el contrario, las células animales utilizadas en el estudio (i.e. linfocitos tipo T de ratón y SeUCR de insecto) sufrieron rotura celular a un EDR promedio del orden de 107 W•m-3.Contrariamente, un EDR medio bastante inferior, aproximadamente 105W•m-3, produjo una reducción de la viscosidad de membrana en los dinoflagelados. Los resultados permitieron demostrar que P. reticulatum y K. veneficum eran sensibles a fuerzas de corte pero no frágiles en el sentido estricto de la palabra. A diferencia de las células animales que mostraron fragilidad celular sin alteración de la viscosidad de membrana. Es probable que los dinoflagelados presenten algún tipo de mecanismo de respuesta a estímulos mecánicos, que se inicia con estímulos muy breves a valores bajos de EDR siendo la diana primaria la fluidez de la membrana.
Para la determinación de lisis celular en los ensayos comentados anteriormente, se desarrolló previamente un método basado en la determinación de la enzima citoplasmática lactato deshidrogenasa (LDH) liberada al medio de cultivo tras la rotura celular. La mayoría de los protocolos existentes hasta el momento de la experimentación habían sido desarrollados para células animales y no eran apropiados para microalgas. El método desarrollado es simple y sensible. Consiste básicamente en medir la fluorescencia desprendida por el cofactor nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) generado en la reducción del NAD+, previamente adicionado al cultivo, por la LDH presente en el sobrenadante.
La información y conclusiones derivadas de los estudios anteriores sirvieron de base para los estudios de escalado del bioproceso. Los FBRs seleccionados fueron tipo columna de burbujeo (BC-FBR) y panel vertical plano (FP-FBR). La especie seleccionada para esta última fase fue K. veneficum. Para establecer los criterios de escalado se utilizaron las condiciones de burbujeo óptimas establecidas anteriormente: (i) velocidad superficial del gas (UG) ≤ 1.9×10-3 m s-1; (ii) H ≥ 1,25 m. Para el diseño del burbujeador se optó por mantener constante la relación existente entre el diámetro del BC-FBR o el espesor del FP-FBR (D) y el diámetro del orificio óptimo (D/d0≈ 25 mm). Este último criterio de escala es en términos anglosajon es una rule of thumb basada en ensayos preliminares, pendiente de sustentar con estudios de simulación con CFD utilizando BC-FBR con diferentes diámetros. El BC -FBR, con un volumen de trabajo de 80 L, se construyó en metacrilato con las siguientes dimensiones características: D = 2,42m, H = 2m y d0=15 mm. El FP-FBR consistió en una bolsa empotrada dentro de una estructura metálica con forma paralelepipédica (H = 1,30 m; D = 0,09 m; L= 2,6 m), de 310 L de volumen útil. Los factores de escala del BC-FBR y del FP-FBR fueron 28500 y 11500, respectivamente, respecto al volumen utilizado en los ensayos de optimización del medio de cultivo (aportaciones del Capítulo III).
En la fase de cultivo indoor, el BC-FBR se iluminó con tiras de diodos de emisión luz (LED) de distintos colores que permitían emular de forma aproximada el espectro de la luz solar, así como implementar cualquier régimen de iluminación (i.e. nivel de irradiancia, tipo de ciclo de iluminación y frecuencia del mismo). La concentración máxima celular alcanzada operando en modo discontinuo fue 1,2×106cell•mL-1, similar a la reportada en cultivos a pequeña escala. La productividad máxima celular obtenida fue 4.1×104cell•mL-1•dia-1. Los perfiles de irradiancia local se modelaron, las cinéticas de crecimiento fueron interpretadas utilizando estimaciones de la irradiancia promedio en el FBR y la distribución con el tiempo de cultivo del tamaño las zonas fótica y oscura en el cultivo.
En la fase de cultivo outdoor, el BC-FBR se operó en modo semicontinuo y el FP-FBR en modo fed-batch mediante adiciones de stock de nutrientes. La productividad máxima de biomasa alcanzada en ambos fuede aproximadamente 5,7×104 cell•mL-1•dia-1, cerca de la medida en el BC-FBR con iluminación LED, para un régimen de luz similar a la época del año en el que se realizaron los cultivos outdoor. Sin embargo, la concentración máxima alcanzada en el FP-FBR fue casi un 50% inferior a la obtenida en las BC-FBRs. Medidas de la enzima LDH en el sobrenadante nos permitieron verificar la pérdida de la integridad celular de una fracción de la población de células, indicando la posible existencia de estrés hidrodinámico. Los valores más bajos de Fv/Fm respecto a aquellos medidos en las BC-FBRs indicaban estrés celular; aunque posiblemente atribuible también a un posible efecto de fotoinhibición. Esta interpretación es consistente con dos aspectos de diseño fácilmente modificables: (i) el FP-FBR era bastante más delgado que el BC-FBR, consecuentemente mayor probabilidad de sufrir fotoinhibición; (ii) la altura del FP-FBR era de 1.3 m, muy próximo al umbral (1,25 m).
Finalmente, se diseñó y construyó una unidad compacta a escala piloto, controlada por ordenador, para la obtención de un extracto enriquecido en KmTx a partir de la biomasa cosechada en los FBRs. La biomasa es previamente centrifugada para obtener el sobrenadante y el pellet de células. Este último es extraído con metanol. La unidad está diseñada para tratar en modo semicontinuo tanto el sobrenadante como el extracto metanóolico del pellet. Dispone de una etapa de filtración hasta 0,22 µm. La segunda etapa es la de adsorción mediante columnas de fase reversa de gel de sílice modificada con el grupo funcional octadecilo (conocidas como columnas C18). En esta etapa se realizan eluciones con fracciones volumétricas MeOH:H2O crecientes desde 0:100 hasta 100:0. La fracción 80:20 obtenida de tratar el sobrenadante contiene cerca del 100 % de las KmTx disueltas en el mismo; mientras que en el caso del extracto metanólico, no solo la fracción 80:20 estaba enriquecida en KmTx, sino también la 100:0, aunque en menor proporción.
