Optimización de la producción heteróloga de ácido docosahexaenoico en escherichia coli

• Autores: Laura Giner Robles
• Directores de la Tesis: Gabriel Moncalián Montes (dir. tes.), Fernando de la Cruz (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Cantabria ( España ) en 2018
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Antonio Fernández (presid.), María Pilar Garcillán Barcia (secret.), María de los Angeles Vinuesa Navarro (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad de Cantabria
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Ácidos grasos
  • Ciencias de la vida
    • Microbiología
      • Metabolismo bacteriano
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: UCrea
• Resumen
  • español

    Algunas bacterias marinas, como Moritella marina, son capaces de producir el nutracéutico ácido docosahexaenoico (DHA) gracias a un complejo enzimático llamado complejo Pfa. Este complejo expresado heterologamente en Escherichia coli es capaz de producir DHA. El objetivo de esta tesis es encontrar las condiciones genéticas y metabólicas para mejorar la producción de DHA en E. coli u otros organismos.

    Para ello, primeramente, se estudió el patrón de expresión de los promotores nativos, que posteriormente fueron reemplazados por promotores fuertes e inducibles con el objetivo de incrementar la expresión de los genes, y finalmente de DHA. En segundo lugar, se estudió la alteración de los flujos metabólicos provocados por la introducción de la ruta heteróloga, y se optimizó el flujo de carbono con el objetivo de maximizar la disponibilidad de sustratos. Para ello se utilizaron dos estrategias: la adición del inhibidor cerulenina, y la deleción del gen fabH. Ambas estrategias explotan un mecanismo de competición de sustrato en el que la sintesis de ácidos grasos canónica se ve truncada. En tercer lugar, se implementaron distintos mecanismos de acumulación del producto final: la introducción de DHA en triacilgliceridos mediante el uso de un enzima diacilglicerol aciltransferasa, y mediante secreción de DHA al exterior de la célula mediante la expresión de una tioesterasa citoplásmica.

    Por último, se mejoró el crecimiento de E. coli a bajas temperaturas mediante el uso de chaperoninas psicrófilas, Cpn10 y Cpn60, de Oleispira antarctica, con el objetivo de restaurar la actividad chaperona.

    Todas estas aproximaciones han incrementado la eficiencia final del proceso, y podrían ser utilizadas en la optimización de la síntesis de DHA y otros ácidos grasos poliinsaturados.

  • English

    Some marine bacteria, such as Moritella marina, are able to produce certain amounts of the nutraceutical docosahexaenoic acid (DHA) thanks to a specific enzymatic complex called Pfa synthase. Moreover, Escherichia coli heterologously expressing this pfa gene cluster from M. marina is also able to produce DHA. The aim of this study was to find genetic or metabolic conditions to improve DHA production in E. coli or any other microorganism. Firstly, we studied native promoter expression pattern in E.coli and replaced these promoters by inducible pBAD system in order to increase the production of the final product. Secondly, we altered the canonical carbon flux in E.coli to improve the availability of substrates for Pfa complex by two strategies: using the exogenous compound cerulenin, and deleting the main initiation enzyme of a competing pathway. Both strategies exploit a substrate competition mechanism between the native fatty acid synthase from E.coli and the heterologous Pfa complex from M.marina. Finally, we improved E.coli growth at low temperature by introducing two psychrophilic chaperonins, Cpn10 and Cpn60 from Oleispira antarctica, in order to improve protein folding. These approaches have increased the overall efficiency of this process, and could be used for biotechnological optimization in different organisms to synthesize DHA or other polyunsaturated fatty acids.