Resumen de Development of photosensitiser conjugates for furan-oxidation based interstrand crosslinking to nucleic acids
Muchos esfuerzos se han dedicado durante las últimas décadas a desvelar el intrincado puzle que conforman todos los papeles que juegan los ácidos nucleicos en los seres vivos. Los ácidos nucleicos no solo definen la constitución genética de un organismo sino que también participan en procesos enzimáticos y regulan la expresión genética. Por todo ello, existe un gran interés en el desarrollo de nuevas herramientas que puedan ser útiles en aplicaciones para diagnósticos o terapia basadas en estos procesos.
Previamente, se ha sido establecido en el grupo OBCR (Organic and Biomimetic Chemistry) que la introducción de un grupo furano en un oligonucleótido puede logarse de forma sencilla utilizando síntesis automática. Como resultado se obtiene una sonda equipada con un grupo funcional altamente reactivo que ha sido enmascarado y es capaz, una vez que el grupo furano ha sido oxidado, de producir un entrecruzamiento entre cadenas de forma selectiva con la secuencia complementaria. La oxidación del grupo furano se puede lograr o bien usando NBS o bien, de una forma más biocompatible, usando oxígeno singlete. Para la formación de este último, los compuestos azul de metileno y rosa de bengala han sido estudiados en detalle.
El objetivo de este estudio es expandir esta metodología al uso de fotosensibilizadores porfirínicos para la generación de oxígeno singlete con el objetivo final de desarrollar un método que se pueda aplicar en un contexto celular.
Para ello, se seleccionaron tres fotosensibilizadores distintos: la clorina e6 (comercial), una porfirínica tripiridínica (TriPyCOOH) y una ftalocianina de zinc decorada con grupos tert-butilo (TT1).
Primero, se evaluó la habilidad de cada fotosensibilizador para producir el entrecruzamiento entre cadenas cuando se añaden en solución. Para ello, un oligonucleótido modificado con un grupo furano fue hibridado con la cadena complementaia en presencia del respectivo fotosensibilizador para evaluar la generación del entrecruzamiento una vez se produce la irradiacción necesaria. Una cuidados optimización de varios factores se llevó a cabo, incluyendo el tiempo de reacción, la concentración de los fotosensibilizadores, el ratio entre el dúplex y el fotosensibilizador y el tipo de luz utilizada. Fue hallado que de los tres fotosensibilizadores, el uso de Ce6 produce los rendimientos de entrecruzamiento más altos (conversión del 52%) cuando las condiciones son óptimas. TT1 fue capaz de producir el entrecruzamiento solo a bajos rendimientos, debido a su insolubidad en condiciones acuosas que son necesarias para esta reacción.
En el siguiente paso, se planteó la hipótesis de que al conjugar los fotosensibilizadores a la cadena complementaria al oligonucleótido que contiene el grupo furano resultaría en dos mejoras importantes: la generación de oxígeno singlete se produciría cerca del grupo furano y la solubilidad en agua de los fotosensibilizadores sería mayor.
Para conjugar cada fotosensibilizador se usó una estrategia de conjugación distinta, todas ellas basadas en la activación del ácido carboxílico en los fotosensibilizadores seguida por la adicción de un oligonucleótido que contiene un grupo amino. La conjugación de la TT1 fue particularmente problemática y esta reacción tuvo que llevarse a cabo con el oligonucleótido todavía en el soporte sólido donde se había sintetizado, para evitar el uso de condiciones acuosas y los problemas de solubilidad asociados.
Una vez que los tres conjugados fueron sintetizados, se hibridaron al oligonucleótido que contiene el grupo furano y se evaluó la generación del entrecruzamiento. De nuevo, el entrecruzamiento que dio lugar a los rendimientos más altos fue en el que se usó el conjugado con Ce6, gracias una generación suficiente de oxígeno singlete y a una estabilización del dúplex que ocurre como consecuencia de introducir Ce6 en el oligonucleótido. Sorprendentemente, el uso del conjugado con TriPyCOOH no fue capaz de producir el entrecruzamiento, presuntamente debido la gran desestabilización que tiene lugar al introducir este fotosensibilizador y la pobre generación de oxígeno singlete. El conjugado con la TT1 mostró una alta generación de oxígeno singlete y fue capaz de producir el entrecruzamiento entre cadenas pero con rendimientos menores debido a una desestabilización del dúplex debido a la presencia del fotosensibilizador.
Con la idea de permitir el entrecruzamiento con una secuencia no modificada, se sintetizaron y evaluaron sondas doblemente modificadas con un grupo furano y un fotosensibilizador. Sin embargo, la síntesis y el manejo de estas sondas auto-activables fue problemática, probablemente debido a la generación prematura de oxígeno singlete y la consiguiente desactivación de las sondas, y cuando la reacción de entrecruzamiento se intentó llevar a cabo no tuvo éxito en ningún caso.
Como alternativa, se probó el uso de un sistema plantilla en el que el furano y el fotosensibilizador fueron introducidos en oligonucleótidos distintos y posteriormente hibridados a un oligonucleótido más largo sin modificaciones, que los mantiene próximos el uno al otro. Mientras que este enfoque tuvo éxito en un estudio anterior en el que se usaron sondas que contenían azul de metileno y rosa de bengala, en nuestro caso no pudimos demostrar la generación del entrecruzamiento. Debido a falta de tiempo, este enfoque no fue estudiado en más detalle ya que una tercera estrategia fue puesta en práctica (vide infra).
En esta nueva estrategia se estudió el uso de un péptido de penetración celular como transportador. Los ácido nucleicos no son capaces de ganar acceso a las células y se ha descrito el uso de estos péptidos para terapias basadas en el uso de ácidos nucleicos ya que son capaces de asistir en la internalización de los ácidos nucleicos. En concreto, algunos de estos péptidos son capaces de formar complejos supramoleculares entre los péptidos cargados positivamente y los oligonucleótidos cargados negativamente, lo que resulta en la formación de nanopartículas.
En este caso, el uso del péptido conocido como MPG-8, que contiene 21 aminoácidos, se eligió para la formación de complejos con el oligonucleótido que contienen el furano. Al añadir la cadena complementaria y una concentración suficiente de Ce6 como fotosensibilizador, se observó la formación del entrecruzamiento, usando heparina para facilitar la liberación del oligonucleótido cuando es necesario. Posteriormente, MPG-8 fue conjugado a Ce6 y la formación del correspondiente complejo con el oligonucleótido que contiene el furano resultó en la formación de nanopartículas auto-activables que fueron capaces de producir el entrecruzamiento con un oligonucleótido no modificado.
