Porphyromonas gingivalis lps stimulates autophagy using a tlr mediated pathway
- Autores: Ignacio Blasi Beriain
- Directores de la Tesis: Andreu Puigdollers Pérez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Internacional de Catalunya ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Lluís Giner Tarrida (presid.), Carles Subirá i Pifarré (secret.), Montserrat Mercadé Bellido (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
La periodontitis es una enfermedad inflamatoria crónica asociada con los patógenos del complejo rojo. El patógeno más característico del complejo es Phorphyromonas gingivalis (P. g.) (59). P. g. induce efectos sobre el huésped que van desde la pérdida de hueso alveolar mediada por inflamación hasta su recientemente atribuido papel en la patogénesis de la placa aterosclerótica (8-12).
Los patógenos, entre ellos P. gingivalis, han ideado una serie de mecanismos mediante los cuales evaden o subvierten los mecanismos de defensa del huésped para persistir y sobrevivir, contribuyendo así a la infección crónica (35, 60). Uno de estos mecanismos es evitar la degradación mediada por los lisosomas. Los macrófagos son un componente crítico de la defensa del huésped y degradan los patógenos bacterianos en fagolisosomas y / o autolisosomas (61).
Estas vías de degradación también están íntimamente unidas a la superficie celular por TLR. Los agonistas de TLR aceleran la maduración del fagosoma. También estimulan la regulación positiva de la autofagia como un medio por el cual la célula elimina patógenos que podrían haber escapado a la degradación. Con frecuencia los patógenos subvierten el proceso de degradación autofágica y continúan persistiendo y sobreviviendo (62).
La autofagia en los macrófagos se estimula a través del TLR4 induciendo interferón-β (39). El lipopolisacárido (LPS) de P. gingivalis es capaz de actuar como un agonista de TLR2 y / o TLR4 para proceder con la maduración lisosomal del autofagosoma temprano al tardío (27, 63). P. gingivalis sintetiza dos tipos diferentes de LPS; Pg1690 y Pg1435 / 1449. Pg1690 es un lípido A de penta-acilo que es agonista de TLR4 en monocitos humanos y HUVEC (células endoteliales de venas umbilicales humanas) (27, 64). Pg1435 / 1449 es una especie de lípido A en forma tetra-acilada. Es un antagonista de Pg1690.
La autofagia y la fagocitosis comparten los intermediantes lisosómicos comunes, cuya formación está regulada por una proteína, la melanoregulina (MREG) (65). Recientemente se ha reportado de que el producto del gen mamífero Mregdsu es necesario para la maduración de los lisosomas en fagocitos. La disminución de MREG da lugar a la acumulación e inactivación de enzimas lisosómicas debido a la alcalinización de los lisosomas. Esto conduce a la acumulación de restos fagocíticos no degradados que contribuyen a la acumulación de lipofuscina (65). La pérdida de MREG también da como resultado la secreción de Catepsina D debido a la separación de proteínas (66). Tales defectos en la función de los lisosomas se correlacionan con una mayor persistencia bacteriana que contribuye a la enfermedad crónica como la periodontitis (67). Sobre la base de trabajos previos en los que se demostró que P. gingivalis sobrevive durante 72 h (68) y nuestra observación innovadora que P. gingivalis regula positivamente intermediarios lisosómicos y que trafica a autofagosomas en macrófagos; propusimos que P. gingivalis regula positivamente procesos de autofagia. Específicamente, propusimos que la regulación positiva de la formación de autofagosomas es crítica para la supervivencia de P. gingivalis en macrófagos y requiere maduración de lisosomas mediada por MREG.
En estos estudios, proporcionamos evidencia de que la estimulación con LPS1690 de células Saos de GFP-LC3 aumenta la autofagia tal y como se detecta mediante una mayor formación de punta LC3 (Artículo 1-Fig. 2 y Fig. 4C) así como la lipidación de LC3 a LC3II (Artículo 1-Fig. 5A y B). El tamaño de los autofagosomas que contenían LPS1690 GFP-LC3 (Artículo 1-Figuras 3A y B) era aproximadamente 4 veces el tamaño de los autofagosomas medios, 3,5-4,0 μm en comparación con 0,5-1,0 μm respectivamente (46). Tales estructuras autofagomales de gran tamaño que no se vieron en la inanición de las células Saos2 (Artículo 1-Material Suplementario Figura 1A), sugiere la especificidad de señalización en la disposición de estas estructuras con LPS1690. En presencia de LPS1435 / 1449, los grandes autofagosomas inducidos por Pg LPS1690 se redujeron en tamaño en un 50%, hasta 1,0 a 1,5 μm (Artículo 1-Figura 4A). Además, los niveles de LC3II y la formación de puncta LC3 se redujeron en presencia del antagonista Pg LPS1690, LPS1435 / 1449 (Artículo 1-Fig. 4A y B). Además, Atg5 niveles mostraron una disminución en células OKF64-TERT tras la estimulación de LPS1690 y LPS1435 / 1449 (Artículo 2-Fig. 1A y B). Curiosamente, se demuestra que la estimulación con LPS1690 y LPS1435 / 1449 de células OKF64-TERT también intensifica la autofagia tal y como se detectó en el aumento de LC3II / LC3I niveles con pocos cambios en un período de tiempo más corto (Artículo 2-Fig. 1A y C).
Además, seguimos el perfil de distribución de las proteínas en células epiteliales gingivales aisladas de tejido periodontal obtenido de individuos sanos y enfermos (Artículo 1-Fig.6). Los niveles de LC3II / LC3I fueron consistentemente más bajos en las células enfermas después de la incubación con LPS1690 (Artículo 2-Tabla 1). Sin embargo, después de la estimulación de LPS1690, LC3 consistentemente aumentó en células epiteliales sanas. Los niveles de ATG5 fueron iguales en células epiteliales aisladas de pacientes enfermos moderados (Artículo 2-Fig. 2C). Estos resultados sugieren que la encía humana se convierte en refractaria a LPS1690 sobre disbiosis microbiana asociada con periodontitis crónica.
De manera similar, a nuestras observaciones de LC3, su proteína de unión, MREG, se elevó con puntas positivas de MREG formadas tras 30 minutos de incubación con Pg LPS1690. La adición de LPS1435 / 1449 inhibió la regulación positiva de MREG. Curiosamente, en contraste con nuestros estudios publicados anteriormente en los que la absorción de Pg (33277) dio lugar a la asociación de LC3 con su pareja vinculante, MREG, en estos estudios Pg LPS1690 indujo un aumento en ambas proteínas, pero no su co-localización, lo que sugiere que la fagocitosis activa es necesaria para la degradación dependiente de LC3 mediada por MREG (20). Colectivamente, estos resultados sugieren que el agonista débil TLR4 Pg LPS1690 activa la autofagia y es necesaria para la formación de grandes autofagosomas, en ausencia de absorción bacteriano, reforzando el papel de TLR4 como sensor autofágico en la eliminación del patógeno (34, 39).
Similar a la respuesta de LC3, se muestra que los niveles MREG fueron elevados después de la estimulación de las células OKF64-TERT con LPS1690. Sin embargo, la incubación con LPS1435 / 1449, disminuyó MREG, lo que sugiere que el proceso de autofagia podría ser inadecuado (Artículo 2-Fig. 1A y D). En las células epiteliales gingivales, los niveles de MREG y beclin no siguieron el mismo patrón que ATG5 y se encontró que disminuyeron la mitad y ¼ respectivamente, lo que sugiere que el eje de la autofagia puede estar comprometido en pacientes enfermos (Artículo 2-Fig.2 A y B). Tratamos ambos grupos de células con LPS1690 para observar la diferencia de respuestas de autofagia entre las muestras sanas y epiteliales de la enfermedad. En presencia de LPS1690, hubo un mayor nivel de ATG5 y MREG en células de tejido sano, sin embargo, dicho aumento no se observó en células aisladas de sujetos con enfermedad moderada (Artículo 2 - Fig. 2E). Por lo tanto, estos resultados consistentes pueden indicar que la vía autofágica está comprometida en pacientes con enfermedad periodontal.
En nuestros estudios, Pg (33277) se encontró que interiorizó, sin embargo, no era detectable en estructuras positivas de LC3 (Artículo 1-Fig. 1). Las diferencias en la internalización y los patrones de tráfico intracelular y la inducción de autofagia puede deberse a un truncamiento en el gen PG07171 (gen de la lipoproteína) en Pg (33277) que está presente en su forma de longitud completa en PgW83 (58). Además, se observó, en células epiteliales gingivales humanas aisladas, una co-localización entre LC3 y MREG en individuos gravemente afectados sin ninguna co-localización entre estas proteínas en individuos sanos o moderadamente afectados. La degradación dependiente de LC3 mediada por MREG es necesaria para la eliminación de los desechos lipídicos (20) y se propone la eliminación de bacterias. La observación de que LC3 y MREG-colocalizan sólo en las células de los pacientes gravemente afectados sugieren que este sistema de eliminación puede estar sobrecargado. Colectivamente, estos resultados sugieren que las mutaciones en MREG y / o LC3 pueden contribuir a una predisposición a la periodontitis crónica.
En conclusión, se ha demostrado que el LPS regula positivamente la formación de autofagosomas de una manera dependiente de TLR. Además, proponemos que las mutaciones en MREG y / o LC3 puede favorecer a una susceptibilidad a la enfermedad periodontital crónica. A pesar de que más investigación es necesaria en este ámbito, nuestros resultados sirven para entender mejor el mecanismo a través del cual P. gingivalis evade la degradación intracelular que conduce a la supervivencia bacteriana.
