Resumen de Ingeniería de catalizadores bienzimáticos de amino oxidasa y catalasa: eliminación de aminas biógenas en vino
- español
Las aminas biógenas son compuestos tóxicos presentes en alimentos y bebidas fermentadas, como el vino, que llevan asociado un relevante problema de seguridad alimentaria; pueden causar problemas de salud además de alterar las propiedades organolépticas del alimento. Las amino oxidasas son las enzimas multiméricas capaces de llevar a cabo su degradación. Pese a que las enzimas son excelentes catalizadores en Química de Alimentos: modifican selectivamente un único substrato en una mezcla muy compleja en condiciones experimentales muy suaves, para su uso biotecnológico a escala industrial tienen que estar altamente optimizadas.
En esta Tesis Doctoral se aborda la Ingeniería de catalizadores bi-enzimáticos inmovilizados para la degradación de aminas biógenas en vinos. Se pretende desarrollar nuevas estrategias de preparación de biocatalizadores bi-enzimáticos amino oxidasa/catalasa con muy buenas propiedades de actividad y estabilidad. Con ese fin, se utilizaron diferentes técnicas que permitieron estabilizar la enzima principal, la amino oxidasa de Pisum sativum. En primer lugar, se llevó a cabo su estabilización por unión covalente multipuntual a soportes glioxil-agarosa, a través de dos orientaciones diferentes. En segundo lugar, se abordó la estabilización de la enzima por sinergia de dos estrategias: la agregación de enzimas en condiciones suaves y la unión covalente multipuntual de agregados enzimáticos sobre soportes glioxil-agarosa. Todos estos derivados presentan alta estabilización respecto a la enzima soluble. Además, se buscó la estabilización adicional de los derivados inmovilizados de amino oxidasa por PEGilación intensa con modificación química mínima, utilizando polímeros dextrano-aldehído como andamio, consiguiendo una estabilización global del orden de miles de veces respecto a la enzima soluble.
La eliminación del peróxido de hidrógeno, producido como subproducto en la reacción de oxidación de aminas biógenas, es un proceso clave ya que este puede inactivar la amino oxidasa y modificar otros componentes presentes en la matriz del alimento. Para ello, se diseñaron catalizadores bi-enzimáticos amino oxidasa/catalasa con diferentes distribuciones de las dos enzimas dentro de un sólido poroso. Se comprobó que la co-localización de las dos enzimas es clave para una eliminación instantánea del peróxido de hidrógeno en el interior de la estructura porosa del soporte. Siguiendo esta estrategia, se pudieron elaborar derivados co-localizados de muy alta carga enzimática con los que se evaluó la degradación de aminas biógenas en vino. Los resultados más relevantes mostraron una eliminación muy rápida del 95% de putrescina e histamina en vino sintético: siendo 80 veces más rápida con en biocatalizador bi-enzimático óptimo que con un catalizador mono-enzimático no óptimo de amino oxidasa.
- English
Biogenic amines are toxic compounds found in fermented foods, such as wine, that could cause a relevant problem of food safety as they cause health problems and could alter the organoleptic properties of food. Amine oxidases are the multimeric enzymes responsible of its degradation. Although enzymes are excellent catalysts for Food Chemistry, as they could selectively modify an unique substrate in a complex matrix under mild experimental conditions, they have to be optimized for its biotechnological use in industry.
The main objective of this PhD Thesis has been developing the engineering of bi-enzymatic catalysts to degrade biogenic amines in wine. It is intended to carry out new strategies to prepare bi-enzymatic amine oxidase/catalase biocatalysts with improved activity and selectivity properties. In order to stabilize the principal enzyme (amine oxidase of Pisum sativum) different stabilization techniques were analyzed. First of all, its stabilization by multipoint covalent immobilization on glyoxyl agarose supports was accomplished via two different orientations. Secondly, it was studied the synergy between two strategies: enzyme aggregation under mild conditions and multipoint covalent attachment of enzymatic aggregates on glyoxyl agarose supports. All of these derivatives achieved very high stabilization factors in comparison with the soluble preparation of the enzyme. Furthermore, the aditional stabilization of immobilized amine oxidase by PEGilation with minimal chemical modification was intented, using dextran-aldehyde as scaffold, obtaining a global stabilization of a thousand times compared with the soluble enzyme.
The decomposition of hydrogen peroxide, a byproduct of biogenic amine oxidation which is able to inactivate the amine oxidase enzyme and modify other food compounds, is a key process. Thus, different bi-enzimatic derivatives of amine oxidase and catalase with different distributions on porous supports were elaborated. The efficient and instantaneous elimination of hydrogen peroxide was achieved co-immobilizing and co-localizing both enzymes inside the structure of the porous support. Therefore, highly loaded co-localized biocatalysts were obtained and their efficacy against biogenic amine degradation in wine was probed. The best result was the rapid elimination of 95% of putrescine and histamine in synthetic wine, being the optimum bi-enzymatic catalyst 80 times faster than the mono-enzymatic biocatalyst of amine oxidase.
