Identificación de nuevos marcadores moleculares y/o celulares implicados en la respuesta farmacológica y contribución de mecanismos de splicing en los tumores hipofisarios
- Autores: María del Carmen Vázquez Borrego
- Directores de la Tesis: Rául Miguel Luque Huertas (dir. tes.), Justo P. Castaño Fuentes (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Manuel José Tena Sempere (presid.), Mercedes Robledo Batanero (secret.), Adrian F. Daly (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad de Córdoba
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Helvia
- Resumen
1. Introducción o motivación de la tesis La hipófisis es una glándula endocrina de pequeño tamaño, pero de vital importancia, localizada en la base del cerebro y constituida por dos regiones anatómica y funcionalmente diferentes, una glandular, la adenohipófisis, compuesta por los lóbulos anterior e intermedio, y otra de origen neural, la neurohipófisis o lóbulo posterior. La adenohipófisis está compuesta por cinco tipos de células endocrinas productoras de hormonas entre las que se encuentran las células somatotropas, lactotropas, corticotropas, gonadotropas y tirotropas, las cuales sintetizan y secretan hormona del crecimiento (GH), prolactina (PRL), corticotropina (ACTH), hormonas foliculoestimulante (FSH) y luteinizante (LH), y tirotropina (TSH), respectivamente [1, 2].
La hipófisis es responsable del control de múltiples funciones biológicas (crecimiento, reproducción, metabolismo, respuesta al estrés, etc.) y está regulada por una compleja de red de señales moduladoras que actúan a través de receptores para integrar y procesar toda la información recibida con el fin de controlar la síntesis y secreción de las diferentes hormonas hipofisarias. Esta fina regulación es ejercida por señales centrales hipotalámicas (GHRH, GNRH, CRH, TRH, somatostatina, dopamina, etc.) y periféricas (glucocorticoides, adipoquinas, hormonas tiroideas, testosterona, estrógenos, ghrelina, obestatina, etc.) y el adecuado balance entre todas estas señales aseguran el apropiado funcionamiento de la glándula y, por lo tanto, del organismo [3].
La alteración neoplásica de algunos de los tipos celulares hipofisarios da lugar al desarrollo de los tumores neuroendocrinos hipofisarios, los cuales constituyen el 15% de todos los tumores cerebrales [4, 5], y suelen ir acompañados de numerosas comorbilidades (ej. infertilidad, anomalías en el crecimiento, disfunción sexual, amenorrea, galactorrea, hipogonadismo, etc.) relacionadas con el tamaño tumoral y la secreción inadecuada de hormonas hipofisarias [6]. Diversos estudios han descrito que estos tumores se generan a partir de una expansión monoclonal de células alteradas genéticamente y que una desregulación de los factores reguladores mencionados previamente tendría un papel importante en dicha transformación [7-9]. Desde un punto de vista clínico, los tumores hipofisarios se clasifican en: tumores hipofisarios no funcionantes (NFPTs), gonadotropinomas (FSH/LHomas), prolactinomas (PRLomas), somatotropinomas (GHomas), corticotropinomas (ACTHomas) y tirotropinomas (TSHomas). Aunque la cirugía transesfenoidal es la primera opción terapéutica para pacientes con tumores neuroendocrinos hipofisarios, en muchos casos no se consigue un control adecuado de la enfermedad y es necesario el uso de terapias farmacológicas [10]. En este sentido, los análogos de somatostatina (octreótido, pasireótido y lanreótido) y los agonistas de dopamina (cabergolina) son las opciones terapéuticas más empleadas actualmente en la práctica clínica. Sin embargo, aunque estos fármacos han demostrado tener una alta eficacia reduciendo el tamaño tumoral y/o la hipersecreción hormonal, diversos estudios han demostrado que muchos pacientes son (o se vuelven) resistentes a estos tratamientos [11, 12]. Por ello, es necesaria la búsqueda de nuevas opciones terapéuticas que enriquezcan el conjunto de fármacos actualmente disponibles para tratar estas patologías tumorales.
En este sentido, una de las estrategias actuales para la generación de nuevos fármacos es la síntesis de derivados químicos de drogas actuales (análogos de somatostatina, agonistas de dopamina) que presenten mayor afinidad, potencia y/o eficacia que los actuales. Adicionalmente, una fuente para la identificación de nuevos fármacos es el reposicionamiento de drogas que están actualmente en el mercado y que son clínicamente seguras, como el caso de las biguanidas (como la metformina) y las estatinas, ya que son tratamientos farmacológicos que se emplean habitualmente en la práctica clínica para controlar alteraciones metabólicas causadas por condiciones patológicas como las diabetes, la obesidad o la hipercolesterolemia y que podrían ejercer acciones directas a nivel de la glándula hipofisaria modulando su función bajo condiciones normales y/o patológicas [13-15]. Finalmente, cabe también destacar que aunque la causa inicial de la aparición de los tumores neuroendocrinos hipofisarios aún no se esclarecido por completo, estudios recientes sugieren que la alteración de los procesos fisiológicos de splicing alternativo y la aparición de variantes aberrantes de splicing es una característica común en la mayoría de las patologías tumorales [16-23] y, por lo tanto, podría representar una nueva vía para la identificación de nuevas dianas para el diagnóstico, pronóstico y/o tratamiento de las patologías tumorales.
Por todo esto, el objetivo principal de esta Tesis ha sido profundizar en un conocimiento celular, molecular y clínicamente relevante de la regulación fisiopatológica de la glándula hipofisaria, y de los tumores neuroendocrinos hipofisarios, a través de la identificación de nuevos factores y mecanismos involucrados en la respuesta funcional a diferentes terapias farmacológicas.
2. Contenido de la investigación Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral demuestran, en primer lugar, que las biguanidas (metformina, buformina y fenformina), familia de compuestos antidiabéticos, ejercen efectos directos en células derivadas de diferentes tipos de tumores hipofisarios, reduciendo la proliferación celular y la secreción hormonal, e incrementando la apoptosis en GHomas, al menos en el caso de la metformina. Todos estos efectos parecen estar mediados por la modulación de mecanismos dependientes ([Ca2+]i y ruta PI3K) e independientes de AMPK (ruta de ERK). Además, evaluamos la posible asociación entre el tratamiento con metformina y diversos parámetros clínicos en pacientes con tumores hipofisarios. Sin embargo, el uso de metformina no se relacionó con ninguna variable clínica determinada en nuestra cohorte de pacientes, lo cual podría ser debido al limitado número de pacientes tratados con este fármaco. De forma paralela, encontramos que la metformina puede modular directamente la función de las células somatotropas, corticotropas y gonadotropas normales de dos especies de primates (Papio anubis y Macaca fascicularis) alterando la secreción hormonal, la expresión génica y la señalización celular, todo ello sin afectar a la viabilidad celular. Así, el efecto de la metformina sobre la secreción de GH, ACTH y FSH se produjo a través de las rutas de mTOR, PI3K y de la señalización de Ca2+ intracelular. Además, la ruta de la MAPK también fue esencial para las acciones de la metformina sobre la secreción de GH. Estos resultados podrían tener una gran relevancia traslacional puesto que las acciones inhibidoras de la metformina sobre la secreción de GH y ACTH podrían ser beneficiosas desde el punto de vista metabólico ya que varios estudios han demostrado que el incremento de los niveles circulantes de GH y de glucocorticoides puede desencadenar resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa y diabetes mellitus.
En la misma línea, durante el desarrollo de esta Tesis también se han estudiado los efectos directos de la simvastatina (tratamiento de la familia de las estatinas usado en clínica para reducir la hipercolesterolemia) sobre parámetros funcionales relevantes en cultivos primarios de diferentes tipos de tumores hipofisarios y líneas celulares, así como su efecto en cultivos primarios de células hipofisarias normales procedentes de una especie de primate (Papio anubis). Nuestros resultados demuestran que la simvastatina puede reducir la viabilidad celular y la secreción hormonal en células de tumores hipofisarios a través de la modulación de MAPK. Sin embargo, la combinación de simvastatina con metformina o análogos de somatostatina no produjo ningún efecto aditivo de estos fármacos. Al igual que en el caso de la metformina, exploramos la posible asociación entre el tratamiento con estatinas y diversos parámetros clínicos en pacientes con tumores hipofisarios. En este caso, los resultados revelaron que los pacientes tratados con estatinas mostraron una tendencia a un menor crecimiento extraselar que los pacientes no tratados. En cambio, ningún otro parámetro se relacionó con el uso de estatinas. En relación con las células hipofisarias normales, la simvastatina redujo la secreción de ACTH, GH, PRL, FSH y LH, sin alterar la expresión génica o la viabilidad celular. Estos efectos fueron mediados a través de mTOR y PI3K, y también a través de MAPK en el caso de los efectos sobre ACTH, GH y PRL.
Por otro lado, en esta Tesis hemos identificado y caracterizado, por primera vez, el efecto de dos agonistas específicos del receptor de somatostatina tipo 3 (SST3) sobre parámetros funcionales clave en cultivos primarios de NFPTs. Así, nuestros resultados demuestran que estos compuestos pueden reducir la viabilidad celular, la secreción de cromogranina-A e incrementar la apoptosis, siendo BIM-355 el compuesto más potente. Además, BIM-355 también redujo el crecimiento tumoral en un modelo preclínico de tumor hipofisario de ratón. El estudio de diferentes rutas de señalización reveló que BIM-355 ejerce sus efectos a través de la modulación de las rutas MAPK, PI3K-Akt/mTOR y JAK/STAT. Curiosamente, encontramos una proporción de NFPTs no respondedores a estos fármacos, en los cuales sólo la expresión de SST3 (a nivel de ARNm y de proteína), pero no la de otros subtipos de SSTs, permitió discriminar entre las dos poblaciones (respondedores vs. no respondedores). Así, este estudio proporciona un sólido conjunto de pruebas que demuestran que el SST3 tiene un papel funcional relevante y con potencial terapéutico en la fisiopatología de los NFPTs.
Otra aproximación realizada en esta Tesis ha sido el estudio de los efectos directos de un nuevo compuesto quimérico, conocido como BIM-065 (nueva generación de dopastatina), capaz de unirse a los receptores de somatostatina tipo 2 (SST2) y 5 (SST5) y al receptor de dopamina tipo 2 (D2) sobre diferentes tipos de tumores hipofisarios y líneas celulares. En este sentido, BIM-065 redujo la viabilidad celular y la secreción hormonal e incrementó la apoptosis en diferentes tipos de tumores hipofisarios. Además, el estudio de diferentes rutas de señalización en la línea celular AtT-20 reveló que una breve incubación con BIM-065 (10 min) aumenta los niveles de fosforilación de Akt, lo cual fue seguido de una clara reducción de la proteína antiapoptótica Bcl-2 (lo que apoya el incremento de apoptosis observado en respuesta a BIM-065). En cambio, una incubación a largo plazo (24h) con BIM-065 provocó un aumento en los niveles de fosforilación de ERK1/2. De acuerdo con los datos descritos en la literatura, nuestros resultados podrían sugerir que este compuesto quimérico modula ERK1/2 y Akt a través de la activación preferencial de la señalización dopaminérgica. Más importante aún, y en contraste con datos previos de otros compuestos quiméricos, el tratamiento con BIM-065 no generó ningún efecto estimulador en las células tumorales analizadas.
Finalmente, nuestros resultados también indican que la maquinaria celular responsable del procesamiento y la regulación del proceso de splicing (spliceosoma y factores de splicing) se encuentra diferencialmente desregulada en tumores hipofisarios en comparación con hipófisis normal. Estos resultados también revelaron una huella específica de componentes desregulados de la maquinaria de splicing capaz de discriminar entre cada tipo tumoral y el tejido hipofisario sano. Además, se encontraron varios componentes desregulados (SRSF1, RNU11, RNU4ATAC y RNU6ATAC) de forma común en todos los tumores hipofisarios analizados, lo cual podría sugerir la existencia de alteraciones comunes que estuvieran implicadas en la tumorigenesis de estas patologías y, de hecho, abre el camino hacia la identificación de dianas terapéuticas comunes basadas en la desregulación de estos elementos. Más aún, y en línea con lo anterior, nuestro estudio también demuestra que la alteración farmacológica del splicing con fármacos específicos, como el pladienolide-B (compuesto dirigido contra SF3B1, un componente clave involucrado en el ensamblaje del spliceosoma), es capaz de reducir la viabilidad celular y la secreción hormonal en células de tumores hipofisarios.
3. Conclusión En resumen, los resultados de esta Tesis proporcionan una información novedosa y relevante acerca de los efectos antitumorales que ejercen sobre diferentes tipos de tumores neuroendocrinos hipofisarios distintos fármacos, algunos de ellos utilizados en la práctica clínica habitual con otras indicaciones, y otros que son nuevos fármacos dirigidos contra receptores de somatostatina/dopamina, y que, en conjunto, sugieren que estos compuestos podrían llegar a ser opciones terapéuticas prometedoras en el tratamiento de pacientes con tumores neuroendocrinos hipofisarios. Además, esta Tesis demuestra que la alteración específica de la maquinaria de splicing podría estar involucrada en la génesis de los tumores hipofisarios y podría proporcionar nuevas herramientas para mejorar el diagnóstico, pronóstico y las opciones terapéuticas para estas patologías.
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