Resumen de Biotecnología aplicada al ricino (Ricinus communis l.) para su uso como biofactoría
El ricino (Ricinus communis L.) es una planta que produce un aceite único, enriquecido en más del 90% en ácido ricinoleico (12-hidroxioleato). Esta composición convierte al aceite de ricino en un aceite apto para diversos usos industriales. Además, el aceite de ricino comprende hasta el 50-60% del peso de la semilla, siendo uno de los cultivos de semilla oleaginosa de mayor rendimiento. El cultivo de ricino puede llegar a tener productividades de hasta 3000 kg/ha. Sin embargo, es necesario reducir al mínimo el contenido de proteínas tóxicas como la ricina. Este proyecto de doctorado pretende demostrar que la semilla de ricino es una excelente plataforma para la síntesis de otros ácidos grasos especiales, como los ácidos grasos epoxi o ácidos grasos hidroxi de cadena larga. Para este propósito, hemos desarrollado métodos para transformar (de forma estable y transitoria) las semillas de ricino. Estos métodos nos han permitido transformar las semillas de ricino para producir ácido lesquerólico, silenciar su gen de hidroxilasa (FAH12) y producir algunas líneas que podrían tener cantidades menores de ricina y otras toxinas. Se ha desarrollado un método de transformación transitoria de la semilla de ricino in vivo a través de agroinfiltración del fruto de ricino. Mediante este método se ha podido evaluar la expresión del marcador GUS regulado por distintos promotores. Además, esta técnica ha permitido probar diferentes construcciones genéticas en las semillas de ricino. Así, mediante agroinfiltración transitoria se comprobó una reducción de la cantidad de ácido ricinoleico en la semilla de ricino mediante el uso de dos técnicas diferentes. La reducción de ácido ricinoleico sirvió como prueba para demostrar la modificación genética en ricino, además, la reducción de este compuesto es necesaria para la síntesis posterior de otros ácidos grasos de interés. Las técnicas usadas para la reducción del ácido ricinoleico fueron el silenciamiento génico de la hidroxilasa mediante el uso de una estrucutra en hairpin, hpFAH12, y mediante el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 de edición genética. El descenso de ácido ricinoleico vino acompañado de un aumento de ácido linoleico, hecho no observado en la variedad de ricino alto oleico, OLE-1. Los niveles de ácido ricinoleico fueron del 50% para hpFAH12 y del 40% para CRISPR/Cas9. Por otra parte, se consiguió un aumento significativo de la cantidad de ácido lesquerólico en la semilla de ricino mediante la sobreexpresión de la enzima elongasa de Lesquerella fendelerei, LfKCS3, de manera transitoria. A pesar de que el aumento fue significativo, la cantidad de ácido lesquerólico no superó el 0.6% de la composición de la semilla. Este hecho se atribuyó a la baja disponibilidad de ricinoleic-CoA, sutrato de LfKCS3, en el conjunto de acil-CoA de la semilla. También se transformó transitoriamente la semilla con la enzima epoxigenasa de Stokesia laevis, aunque en ningún momento se detectó la formación de ácidos grasos epoxidados. Además de la transformación transitoria, se optimizaron métodos de transformación estable mediante los cuales se han llegado a obtener plantas de ricino transgénicas. Se han producido plantas transformadas nuclearmente con el plásmido pCambia1305.1 que se usaron como control. La composición del aceite de las semillas de estas plantas no reveleron cambios, algo lógico, ya que pCambia1305.1 no portaba ningún gen que pueda afectar la composición de ácidos grasos de la semilla. También se obtuvieron plantas transgénicas transformadas con hpFAH12, construcción para el silenciamiento del gen de la hidroxilasa (FAH12). Algunas de las semillas obtenidas (T0) mostraron unos niveles de ácidos ricinoleico del 50% aproximadamente, una reducción importante si tenemos en cuenta que una planta salvaje cuenta con un 90% de este compuesto. Además, las semillas se dividieron en dos grupos en función de su peso y se observó una correlación lineal entre el peso de la semilla el contenido en ácido ricinoleico. Esta correlación fue exponencial entre la cantidad de aceite de la semilla y el contenido en ácido ricinoleico. La cantidad de aceite de las semillas fue baja. Los embriones de las semillas analizadas se germinaron in vitro para obtener la siguiente generación de plantas transgénicas (T1). Además de la estructura hpFAH12, se usó la tecnología CRISPR/Cas9 para lograr una reducción de este ácido graso en plantas modificadas de manera estable. Las plantas modificadas mediante CRISPR/Cas9, mostraron una serie de mutaciones en el gen FAH12 que repercutieron en una caída de la cantidad de ácido ricinoleico. Estas semillas mostaron un 40% de ácido ricinoleico, una reducción aún mayor que con hpFAH12. Al igual que con hpFAH12, la reducción de ácido ricinoleico vino acompañada de un aumento de ácido linoleico. La cantidad de aceite de las semillas también fue baja. Para reducir la cantidad de toxinas en la semilla, se usó la técnica CRISPR/Cas9 para generar mutaciones en la toxina ricinica y en toxinas homólogas. Se obtuvo una planta con el gen de la ricina mutado. En cuanto se obtengan semillas de esta planta, se analizarán para verificar una disminución de la toxicidad de la misma. Finalmente, se llevaron a cabo estudios bioquímicos de asimilación de precursores por parte de la semilla de ricino. Se comprobó la capacidad de incorporación de la semilla de ácidos grasos hidroxilados al cuerpo de triacilgliceroles (TAG). El ácido ricinoleico, como ya se esperaba, tuvo una velocidad mayor de incorporación directa a TAG seguido del ácido lesquerólico. El ácido oleico, no hidroxilado, mostró una cinética menor y una incorporación a lípidos polares precedida de la incorporación a TAG.
