Resumen de Production and molecular characterization of NAD+ related enzymes and their advanced intermediates
- español
En la Tesis Doctoral titulada "Producción y caracterización molecular de enzimas relacionadas con NAD+ y sus intermedios avanzados", los objetivos fueron: el desarrollo de un método enzimático para la obtención de nicotinamida mononucleótido (NMN) y nicotinamida ribósido (NR); el diseño de un método de cribado funcional para la obtención de nicotinamidasas/pirazinamidasas en librerías metagenómicas/ poligenómicas; la aplicación del método de cribado desarrollado para encontrar nuevas nicotinamidasas/pirazinamidasas metagenómicas en ambientes extremos; el análisis del genoma de la trufa negra para asignarle actividad nicotinamidasa/pirazinamidasa a una proteína no caracterizada en base a su caracterización funcional; y la caracterización bioquímica y estructural de una proteína no caracterizada de Oceanobacillus iheyensis como un nuevo macrodominio bacteriano.
Para obtener NMN y NR puros, una difosfatasa de NAD+ y una 5'-nucleotidasa bacterianas se clonaron y purificaron. La primera enzima se utilizó para convertir NAD+ en NMN y AMP, siendo este último separado del NMN por cromatografía de intercambio iónico. El NMN obtenido se transformó en NR con la 5'-nucleotidasa. Asimismo, ambos compuestos fueron testados y comparados con la fuente comercial de NMN en dos modelos celulares, encontrando, por primera vez, un mejor incremento de los niveles de NAD+ en uno de los dos modelos tratado con nuestros compuestos.
Para el cribado funcional de nicotinamidasas/pirazinamidasas se desarrollaron dos métodos basados en la reacción de los productos de reacción de las nicotinamidasas (el ácido pirazinoico y el ácido nicotínico) con el sulfato amónico ferroso (AFS) y el nitroprusato de sodio (SNP). Una vez establecidas las condiciones óptimas de los ensayos, se estudió una librería de fósmidos poligenómica, encontrando varios clones positivos con el método del AFS. La detección de actividad de forma cuantitativa con el método del SNP nos permitió descubrir la primera nicotinamidasa con actividad balanceada frente a nicotinamida y pirazinamida. Además, su caracterización bioquímica hizo posible el desarrollo de un método para el cribado de inhibidores de nicotinamidasas.
Utilizando el método descrito anteriormente se descubrió la primera nicotinamidasa hipertermófila procedente de una bacteria no clasificada (UbNic), con una temperatura óptima de 90 °C y un amplio pH óptimo. La enzima mostró una de las eficiencias catalíticas más altas entre las nicotinamidasas de bacterias no patógenas. Asimismo, su secuencia de unión a metal fue descrita y catalogada en un subgrupo no descrito hasta ahora.
Con el conocimiento adquirido en el campo de las nicotinamidasas, se realizó un análisis bioinformático con el fin de identificar un nuevo gen de trufa como una posible nicotinamidasa. La presencia del gen en el micelio del hongo se demostró con el método del AFS descrito anteriormente. Después de su expresión y purificación recombinante, se realizó una caracterización bioquímica de la proteína, la cual mostró una clara preferencia por nicotinamida frente a pirazinamida. Asimismo, la enzima mostró un patrón de inhibición característico frente a los diferentes aldehídos probados.
Finalmente, la caracterización funcional y estructural del macrodominio de Oceanobacillus iheyensis nos permitió profundizar en el conocimiento de su mecanismo de catálisis y unión a sustrato. Las estructuras cristalinas de los mutantes D40A, N30A y G37V, así como las obtenidas con MES, ADP-ribosa y ADP, permitieron la identificación de cinco moléculas de agua encargadas de la unión a sustrato. Asimismo, se demostró que el cierre del lazo ?6-?4 es esencial para el reconocimiento del pirofosfato y la orientación de la ribosa distal. Además, se encontró que OiMacroD cataliza tanto la hidrólisis de O-acetil-ADP-ribosa como la eliminación de residuos de ADP-ribosa de proteínas ribosiladas. Finalmente, el estudio del mutante G37V demostró la participación de una molécula de agua coordinada con el sustrato que ayuda a mantener la correcta conformación del mismo.
- English
In the PhD Thesis entitled "Production and molecular characterization of NAD+-related enzymes and their advanced intermediates", the objectives were: the development of an enzymatic synthesis method in order to obtain pure nicotinamide mononucleotide (NMN) and nicotinamide riboside (NR); the design of a functional screening method to discover new nicotinamidases/pyrazinamidases in metagenomic/polygenomic libraries; the application of the developed functional screening to find new extremophile metagenomic nicotinamidases/pyrazinamidases; the analysis of the black truffle genome to assign a putative protein as a nicotinamidase/pyrazinamidase based on its functional characterization; and the biochemical and structural characterization of a hypothetical protein from Oceanobacillus iheyensis as a MacroD-like macrodomain.
To obtain pure NMN and NR, a bacterial NAD+-diphosphatase and 5'-nucleotidase were cloned and purified. The first enzyme was able to convert NAD+ into NMN and AMP, being the latter compound separated from NMN by ion exchange chromatography. The NMN obtained was fully transformed into NR by the 5'-nucleotidase. Furthermore, both compounds were tested and compared with commercial NMN in two cellular models, finding not only the same NAD+ increase in one of the cell types but also, for the first time, a higher increment in the NAD+ levels of the other cellular model treated with our enzymatic compounds.
For the functional screening of nicotinamidases/pyrazinamidases, two new whole-cell methods were developed using the chemical property of the products formed in the enzymatic reaction catalyzed by nicotinamidases (pyrazinoic or nicotinic acids) to form colored complexes with the stable iron salts ammonium ferrous sulfate (AFS) or sodium nitroprusside (SNP). After the optimization of the conditions, a fosmid polygenomic library was screened, discovering several positive clones with the AFS method. Their quantitative re-screening with the SNP method allowed us to discover the first nicotinamidase with balanced catalytic efficiency towards nicotinamide and pyrazinamide. Its biochemical characterization has also made possible the development of the first high-throughput whole-cell method for prescreening of nicotinamidase inhibitors by the naked eye.
Using the previously developed method, together with bioinformatics, the first hyperthermophilic nicotinamidase from an unclassified bacterium (UbNic) was found, with an optimum temperature of 90 °C and a broad optimum pH. The enzyme showed one of the highest catalytic efficiencies among non-pathogenic bacterial nicotinamidases. Furthermore, the sequence of the metal binding site revealed that UbNic and its related sequences belong to a subgroup not described so far.
With the knowledge acquired in the field of nicotinamidases, a bioinformatic analysis was performed to identify a new gene from truffle as a putative nicotinamidase. Its presence in the mycelium of the fungus was demonstrated with the AFS method developed before. After its recombinant expression and purification, a biochemical characterization of the protein was carried out, finding that this nicotinamidase has a clear preference for its natural substrate (NAM) than for pyrazinamide. The enzyme also had a unique inhibition pattern with different aldehydes.
Finally, the functional and structural characterization of the macrodomain from Oceanobacillus iheyensis allowed us to shed light on its substrate binding and catalysis. The crystal structures of D40A, N30A and G37V mutants, and those with MES, ADP-ribose and ADP bound, led us to the identification of five fixed water molecules that play a significant role in substrate-binding. Furthermore, the closure of the ?6-?4 loop was revealed as essential for pyrophosphate recognition and distal ribose orientation. In addition, a novel structural role for residue D40 was identified. Moreover, it was revealed that OiMacroD catalyzes the hydrolysis of O-acetyl-ADP-ribose and also reverses protein mono-ADP-ribosylation. Finally, mutant G37V supports the participation of a substrate-coordinated water molecule in catalysis that helps to select the proper substrate conformation.
