Variantes mutacionales no seleccionadas de la fosfatasa alcalina de "Escherichia coli"
- Autores: Francisco del Castillo Román
- Directores de la Tesis: Enrique Cerdá Olmedo (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 1982
- Idioma: español
- ISBN: 9788469393512
- Tribunal Calificador de la Tesis: Enrique Cerdá Olmedo (presid.), Juan Ramón Medina Precioso (secret.), Arturo Gullon Mazarron (voc.), José María Vega Piqueres (voc.), Antonio Rodero Franganillo (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
La polémica sobre la importancia relativa de la selección y de la deriva genética en el polimorfismo y la evolución moleculares (neutralismo contra seleccionismo) se encuentra estancada y la solución parece depender del desarrollo de nuevas vías experim ... entales.En esta Tesis se han investigado en la fosfatasa alcalina de Escherichia coli el espectro mutacional naciente (conjunto de variantes mutacionales espontáneas) y el espectro establecido en poblaciones naturales. Mediante la comparación de ambos espectros se pretende determinar qué proporción de las mutaciones nuevas están sometidas a selección, que parámetros enzimáticos influyen y en qué medida, permitiendo así un nuevo enfoque de la polémica.El estudio del espectro mutacional naciente de una enzima ha sido imposible hasta ahora por la rareza de la mutación y la necesidad de evitar cualquier procedimiento selectivo que pudiera sesgar el conjunto de variantes estudiadas. El empleo de la comutación con nitrosoguanidina entre el gen estructural de la fosfatasa (phoA) y el gen proC ha permitido el estudio sistemático del espectro mutacional protótrofos obtenidos tras el tratamiento con nitrosoguanidina de un auxótrofo proC presentan variaciones en la fosfatasa. Estas variantes no han sido sometidas a ningún proceso selectivo y, además, la síntesis de la enzima estuvo reprimida durante la obtención de las estirpes a investigar. Por tanto, dichas variantes constituyen una muestra no sesgada del espectro mutacional naciente de la fosfatasa.Se han ensayado métodos rápidos, fiables y precisos para la detección de variantes de la fosfatasa atendiendo a la movilidad electroforética, la termoestabilidad, la actividad, la cinética, la curva actividad/pH y la energía de activación. La aplicación de dichos métodos a la detección y caracterización bioquímica de variantes de la fosfatasa en estirpes naturales (espectro establecido) y estirpes mutantes (espectro naciente) ha permitido obtener las siguientes conclusiones:1. La comutación con nitrosoguanidina incrementa unas 6000 veces la frecuencia de variantes mutacionlaes de una enzima respecto al nivel espontáneo y permite la búsqueda sistemática de variantes sin exigir a priori ninguna variación fenotípica.2. La electroforesis en condiciones óptimas permite detectar la gran mayoría de las sustituciones de aminoácidos y no sólo aquéllas que implican aminoácidos con distinta carga eléctrica.3. La termoestabilidad es un parámetro muy eficaz para la detección de variantes enzimáticas, sobre todo en combinación con la electroforesis.4. Otros parámetros enzimáticos, como la actividad, la cinética, la curva actividad/pH y la energía de activación, tienen escaso poder de detección de variantes pero pueden ser muy útiles para la caracterización bioquímica de las variantes enzimáticas.5. La fosfatsa alcalina es polimórfica en la población hospitalaria sevillana de Escherichia coli, habiéndose encontrado 5 alelos distintos entre 50 estirpes naturales investigadas. La selección purificadora puede explicar el estrecho parecido entre las avriantes naturales más abundantes y la fosfatasa de las estirpes de laboratorio.6. La comparación de las variantes naturales y las obtenidas por comutación sugiere la existencia de abundantes alelos selectivamente neutros de la fosfatasa.
