Alteraciones en el procesamiento del pre-arnm de los genes pkd1 y pkd2 debidas a mutaciones exónicas relacionadas con la enfermedad poliquística renal autosómica dominante
- Autores: Francisco Javier González Paredes
- Directores de la Tesis: Rafael Castro Fuentes (dir. tes.), Félix Claverie Martín (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de La Laguna ( España ) en 2011
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Mariano Hernández Ferrer (presid.), Agustin Valenzuela Fernandez (secret.), Félix Machín (voc.), Francisco J. Rodríguez Esparragón (voc.), María Díaz Torres (voc.)
- Materias:
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- Resumen
En los últimos años se ha resaltado la importancia de las variantes genómicas que alteran el procesamiento o maduración del pre-ARNm (también llamado splicing) y que causan diversas enfermedades. Se estima que, aproximadamente, el 15% de las mutaciones causantes de enfermedad afectan el proceso de maduración del pre-ARNm. De esta forma, mutaciones intrónicas tales como las que afectan a los sitios donador y aceptor del splicing, la secuencia de anclaje (o branchpoint), y la región rica en pirimidinas son, frecuentemente, causa de enfermedades. Asimismo, mutaciones localizadas en la región codificante del gen también pueden mostrar este mismo efecto. Estas mutaciones pueden modificar, alterar o destruir secuencias exónicas reguladoras del splicing lo que, en definitiva, conduciría al mal procesamiento del pre-ARNm del gen y su inadecuada expresión.
El procesamiento o maduración del pre-ARNm es una modificación co-transcripcional que ocurre sobre la primera molécula de ARN mensajero no maduro (pre-ARNm) sintetizada en el núcleo de la células eucariotas. Esta molécula es una primera copia del gen trascrito, la cuál contiene secuencias exónicas e intrónicas no codificantes. Durante este procesamiento, la molécula de pre-ARNm es sometida a una serie de reacciones enzimáticas por las cuales los intrones son eliminados y los exones se unen de forma consecutiva, obteniéndose una molécula de ARN mensajero (ARNm) maduro.
Existen diversas secuencias implicadas en este proceso, localizadas tanto en regiones intrónicas como en regiones exónicas, e incluyen sitios de unión de proteínas encargadas del splicing, secuencias consenso de reconocimiento de unión exón-intrón (arriba mencionadas) y secuencias reguladoras del splicing. Las secuencias reguladoras pueden ser amplificadoras (sitios ESE o ISE, del inglés Exonic Splicing Enhancer o Intronic Splicing Enhancer) o inhibidoras/silenciadoras (sitios ESS o ISS, del inglés Exonic Splicing Silencer o Intronic Splicing Silencer). Estas secuencias modulan la capacidad de la maquinaria celular encargada de llevar a cabo el procesamiento del pre-ARNm, de reconocer las secuencias presentes en la molécula inmadura como verdaderos exones o intrones que han de ser incorporados o no, a la molécula de ARN final.
Las mutaciones exónicas (de cambio de sentido y sinónimas) pueden afectar la expresión de un gen no solo a nivel de la proteína para la cuál codifica, sino a nivel de la maduración del pre-ARNm generado en los primeros estadios del proceso de trascripción. Estas alteraciones pueden ser debidas a la modificación de las regiones reguladoras y/o las secuencias consenso necesarias para la correcta identificación de las secuencias codificantes en la molécula de ARNm maduro.
La enfermedad poliquística renal autosómica dominante (o ADPKD, del inglés Autosomic Dominant Polycystic Kidney Disease) es la afección renal monogénica más común con una incidencia de 1/400 a 1/1000 y es una causa importante de insuficiencia renal. El desorden es genéticamente heterogéneo con dos genes identificados: PKD1 (16p13.3) y PKD2 (4q21). En el 85% de los casos, el gen que se encuentra afectado es el PKD1, mientras que el PKD2 es responsable de cerca del 15% restante.
Metodológicamente, el estudio se ha basado en la selección y análisis, mediante herramientas informáticas específicas, de las mutaciones descritas en los genes PKD1 y PKD2 encontradas en pacientes con ADPKD, que pudieran estar alterando las secuencias reguladoras del procesamiento del pre-ARNm. A continuación, se construyeron minigenes incluyendo el o los exones de interés de secuencia salvaje y sus regiones intrónicas flanqueantes. Seguidamente, se introdujeron, mediante técnicas de mutagénesis dirigida, las sustituciones nucleotídicas seleccionadas. Los minigenes de secuencia salvaje y los mutantes fueron utilizados en la transfección de líneas celulares derivadas de células de riñón. El ARN total obtenido de estos cultivos fue analizado mediante RT-PCR y secuenciación directa para determinar qué mutaciones realmente alteraban el proceso de maduración del ARNm.
