Clonaje y expresión en Saccharomyces cerevisiae del gen TRK 1 de neurospora crassa que determina un transportador de potasio de alta afinidad

• Autores: Loreto Sainz Pastor
• Directores de la Tesis: Alonso Rodríguez Navarro (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Politécnica de Madrid ( España ) en 1997
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Tomás Ruiz Argüeso (presid.), Juan Imperial Ródenas (secret.), José Ramos Ruiz (voc.), Claudio Fernández Heredia (voc.), Rosario Lagunas Gil (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Microbiología
      • Metabolismo microbiano
      • Micología (levaduras)
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• Resumen

  • Se ha clonado un gen de neurospora crassa, el gen nctrk1, implicado en la entrada de k+ de alta afinidad. Este gen se aisló complementando la entrada defectuosa de k+ de un doble mutante de saccharomyces cerevisiae con una genoteca genomica de n.Crassa. El gen nctrk1 de n.Crassa complemento la entrada defectuosa de k+ de los mutantes trk1 trk2 de s.Cerevisiae. La secuencia de aminoácidos traducida del gen nctrk1 mostró un 63 y un 60% de homología con los transportadores de k+trk1 y trk2 de s.Cerevisiae respectivamente. Esta homología se produjo en mayor medida en la region que contiene los doce fragmentos intermembrana. Sin embargo, en el alineamiento de las secuencias se observo una similitud superior de nctrk1 con trk2 de s.Cerevisiae, siendo la carencia de la larga región hidrofilica situada entre los fragmentos m3 y m4 presente en trk1 la caracteristica mas notable. Este gen se caracterizo por la presencia de un intron de 50 pb situado en el extremo 5' a 11,5 pb del primer atg de la fase de lectura abierta. La supensión de este intron permitio una mejor expresion del gen nctrk1 en mutantes de levadura en condiciones limitantes de k+. Los mutantes de s.Cerevisiae transformados con nctrk1 se caracterizaron por unas cinéticas de entrada de rb+ diferentes de las observadas en n.Crassa. El sistema de alta afinidad presente en celulas ayunadas mostro una km de 0,1 mm y una velocidad maxima de 7 nmol.Mg-1.Min-1. Para células crecidas a concentraciones milimolares de k+, se observo un sistema de baja afinidad con una km de 4 mm y una vmax de 5 nmol.Mg-1.Min-1. Ambas cineticas presentaron dos compontes: el primero de ellos correspondía al sistema endogeno de la levadura trk1 trk2 y el segundo era propio de nctrk1. Es de destacar también la alta discriminación existente entre k+ y rb+, con una ki para k+ de 5 m en células ayunadas. Los analisis de northem así como la obtención de cdna solamente en células ayunadas de k+ sugieren