Resumen de Clonaje, secuenciacion y localizacion intracelular de la isoenzima bb de la fosfoglicerato mutasa de la rata
EL TRABAJO REALIZADO HA CONSISTIDO EN EL CLONAJE Y LA SECUENCIACION DEL CDNA DE LA FORMA B DE LA FOSFOGLICERATO MUTASA DE RATA (PGM) POR UNA PARTE Y EN EL ESTUDIO DE LA LOCALIZACION INTRACELULAR DE LAS ISOENZIMAS DE LA PGM EN DISTINTOS TEJIDOS DE RATA POR OTRO. PARA LLEVAR A CABO EL CLONAJE, HA SIDO PURIFICADA A HOMOGENEIDAD LA PROTEINA A PARTIR DE CEREBRO DE RATA, UTILIZANDO TECNICAS CROMATOGRAFICAS Y OBTENIDA PURA A HOMOGENEIDAD. SE HAN PREPARADO LOS ANTICUERPOS POLICLONALES CORRESPONDIENTES EN CONEJO. ESTOS ANTICUERPOS MUESTRAN TOTAL ESPECIFICIDAD, RECONOCIENDO UNA UNICA BANDA POR WESTERN-BLOT QUE CORRESPONDE AL PESO MOLECULAR DE LA SUBUNIDAD DE LA ENZIMA. ADEMAS, DAN REACCION CRUZADA CON LA OTRA ISOENZIMA LA FORMA M MUSCULAR. LOS ANTICUERPOS NO SE HAN EMPLEADO PARA EL CLONAJE, PERO SI PARA LOS EXPERIMENTOS DE LOCALIZACION INTRACELULAR. EL CLONAJE, SE HA REALIZADO, UTILIZANDO COMO SONDA EL CDNA DE LA FORMA M PREVIAMENTE AISLADO POR NUESTRO GRUPO. EL CDNA CONSTA DE 1754 PARES DE BASES, CON UNA ZONA CODIFICANTE DE 762 BASES QUE CODIFICA PARA UNA PROTEINA DE 253 AMINOACIDOS 96% HOMOLOGA CON LA FORMA CORRESPONDIENTE HUMANA. LA HOMOLOGIA A NIVEL DE ZONA CODIFICANTE ES DEL 90%. EL CDNA TIENE UNA ZONA NO CODIFICANTE 3' DE 894 PARES DE BASES QUE MUESTRA UNA CONSERVACION CON LA FORMA HUMANA DEL 64%.
A NIVEL DE NORTHERN-BLOT, ESTE CDNA UNICAMENTE RECONOCE UNA BANDA DEL MISMO PESO MOLECULAR QUE EL CDNA.
LOS ESTUDIOS DE LOCALIZACION INTRACELULAR SE HAN REALIZADO MEDIANTE EXPERIMENTOS DE INMUNOCITOQUIMICA Y AISLAMIENTO DE NUCLEOS PUROS DE DISTINTOS ORGANOS. LA INMUNOCITOQUIMICA REVELA MARCAJE NUCLEAR Y CITOSOLICO EN TODOS LOS ORGANOS ANALIZADOS: CEREBRO, HIGADO CORAZON Y MUSCULO ESQUELETICO. AL AISLAR NUCLEOS DE TODOS ESTOS ORGANOS, SE HA OBSERVADO PRESENCIA DE ACTIVIDAD ENZIMATICA Y REACCION ANTIGENO-ANTICUERPO DE LA FOSFOGLICERATO MUTASA, CONFIRMANDO LOS RESULTADOS DE INMUNOCITOQUIMICA.
