Study of membrane proteome of DGKΖ-deficient cytotoxic T lymphocites

• Autores: Gonzalo Martínez Martínez
• Directores de la Tesis: Isabel Mérida De San Román (dir. tes.), Severine Gharbi (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2019
• Idioma: inglés
• Títulos paralelos:
  • Estudio del proteoma de membrana de linfocitos T citotóxicos deficientes en DGKζ
• Tribunal Calificador de la Tesis: Manuel Fresno Escudero (presid.), Miguel Marcilla Goldaracena (secret.), Concepcion Gil Garcia (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Proteínas
  • Ciencias de la vida
    • Inmunología
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen
  • English

    Abstract T cells are key cells in the coordination and implementation of the adaptive immune response. Specifically, cytotoxic T lymphocytes are responsible for eliminating cells presenting antigens on their surface either viral or tumor type. After antigen presentation, these cells must undergo a series of changes in the pattern of protein expression to reinforce the signaling capability and allow movement to the site of action. In case of membrane proteins, there are changes in expression of surface receptors in order to receive chemical signals in the form of cytokines and other molecules, and also in adhesion molecules to allow the exit of the secondary lymphoid organs towards periphery. However, tumor cells can avoid CTL action in some cases, using escape mechanisms which limit their cytotoxic activity.

    Signaling by diacylglycerol (DAG) plays an essential role in antigen presentation. Diacylglycerol kinase (DGK) enzymes family negatively regulates this response by phosphorylation of DAG into phosphatidic acid (PA). ζ isoform (DGKζ) deficient mice CTL show increased activation and better response to tumors. Furthermore, DGKζ deficiency has been associated with changes in protein expression on the cell surface related to cell adhesion. Determining the role of DGKζ deficiency in cell surface protein expression pattern can help to understand key aspects like its effects in tumor elimination.

    In order to better understand the role of the DAG in CTL response, a proteomic study was designed to analyze the expression of proteins of these cells, with special interest in plasma membrane proteins. Firstly, a method of protein enrichment of the plasma membrane by biotinylation was optimized in Jurkat T cells, while other strategies such as subcellular fractionations were also tested to obtain better results. This method was then used with CTL, and changes in the expression pattern of membrane proteins dependent of DAG were studied by adding a phorbol ester (PMA) or by analyzing CTL obtained from DGKζ-deficient mice. To complete this study, a quantitative proteomics analysis was performed by SILAC labeling to determine significant quantitative changes in protein expression from DGKζ-deficient CTL. The results showed a higher expression of cytotoxic components such as granzyme B in the membrane fraction of DGKζ-/- CTL.

    Resumen Los linfocitos T son células fundamentales en la coordinación y ejecución de la respuesta inmune adaptativa. En concreto, los linfocitos T citotóxicos (CTL) se encargan de la eliminación de células infectadas por patógenos intracelulares o células tumorales que presentan en su superficie antígenos específicos. Tras la activación, los CTL experimentan una serie de cambios en el patrón de expresión de proteínas que les permiten aumentar su capacidad de señalización y su desplazamiento hacia los sitios de acción. En el caso de las proteínas de membrana presentan cambios en la expresión de receptores de citocinas y moléculas de adhesión. Sin embargo, las células diana tumorales en algunos casos son capaces de eludir la acción de los CTL mediante mecanismos de evasión que limitan su capacidad efectora.

    La señalización del diacilglicerol (DAG) juega un papel esencial durante la activación de los linfocitos T. La familia de enzimas de las diacilglicerol quinasas (DGK) regula negativamente esta respuesta mediante la fosforilación del DAG y su conversión en ácido fosfatídico (PA). Los CTL de ratones deficientes en la isoforma DGKζ muestran una mayor activación y una mejor respuesta frente a tumores. Además, la deficiencia en DGKζ se ha asociado a cambios en la expresión de proteínas de la superficie celular relacionadas con la adhesión celular. Determinar cómo la deficiencia de DGKζ afecta al patrón de expresión de proteínas de superficie puede ayudar a entender fenómenos como su mayor eficiencia en la eliminación de tumores.

    Para comprender mejor el papel de DGKζ en la respuesta de las CTL, diseñamos una aproximación proteómica para caracterizar las proteínas expresadas en su superficie celular. En primer lugar se optimizó en células T Jurkat un método de enriquecimiento de proteínas de la membrana plasmática mediante biotinilación, a la vez que se ensayaron otras estrategias como fraccionamientos subcelulares para obtener mejores rendimientos. Después se empleó este método con CTL, y se estudiaron los cambios en el patrón de expresión de proteínas de membrana dependientes del DAG mediante la adición de un éster de forbol (PMA) o el análisis de CTL obtenidos a partir de ratones deficientes en DGKζ. Para completar el estudio se realizó un análisis de proteómica cuantitativa mediante marcaje SILAC para determinar cambios cuantitativos significativos en proteínas expresadas en CTL de ratones deficientes en DGKζ. Los resultados arrojaron una mayor expresión de componentes citotóxicos como granzima B en la fracción de membranas de CTL DGKζ-/-.

  • English

    T cells are key cells in the coordination and implementation of the adaptive immune response. Specifically, cytotoxic T lymphocytes are responsible for eliminating cells presenting antigens on their surface either viral or tumor type. After antigen presentation, these cells must undergo a series of changes in the pattern of protein expression to reinforce the signaling capability and allow movement to the site of action. In case of membrane proteins, there are changes in expression of s...