Aplicacio de la mutagenesi dirigida a l'estudi del proces d'interaccio enzim-substrat de la ribonucleasa a

• Autores: Ester Boix i Borràs
• Directores de la Tesis: Victoria Cuchillo Foix (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 1994
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Pere Suau León (presid.), Maria Vilanova Brugués (secret.), Manuel Rico Sarompas (voc.), Ignaci Fita (voc.), Xavier Parés Casasampera (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Enzimología
      • Biología molecular
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• Resumen

  • La ribonucleasa a de pancreas bovino interacciona con su sustrato, el rna, a lo largo de multiples subcentros de interaccion que reconocen principalmente las cargas negativas de los grupos fosfato. El trabajo aqui presentado aporta nuevos datos sobre la existencia del subcentro secundario de fijacion de fosfatos p2 propuesto por pares et al. (eur. J. Biochem. 105, 571-579, 1980), y confirma la funcion de la lys-7, y posiblemente la arg-10, en el establecimiento de una interaccion electrostatica con un grupo fosfato del sustrato. El efecto de la eliminacion de las cargas positivas se ha estudiado mediante las sustituciones lys-7 - gin (k7q) y/o arg-10 - gln (r10q). Se ha desarrollado un nuevo metodo de expresion y secrecion de la ribonucleasa a en e. Coli (schein et al., biochem. J. 283: 137-144, 1992), en el que se ha expresado un gen sintetico para la rnaasa a en la cepa e. Coli lon- htpr- bajo el control del promotor del triptofano, utilizando la secuencia señal de secrecion de la rnaasa pancreatica de raton, con un rendimiento final de 3-6 mg de proteina activa y soluble por litro de cultivo. Los estudios de los parametros cineticos con los sustratos c p, cpa y poli(c), de la actividad sintetica y de la reaccion de modificacion con el nucleotido halogenado cl6rmp, indican que los residuos estudiados modifican la capacidad catalitica del enzima y todos aquellos procesos en los que participa el subcentro secundario de fijacion de fosfatos p2: interaccion con sustratos de alto peso molecular, fijacion de la segunda molecula del sustrato c p en la actividad sintetica y reaccion especifica con el nucleotido halogenado (boix et al., j. Biol. Chem., en prensa).