Resumen de Uso de sustancias naturales como terapia contra el cáncer: terapias combinadas aplicadas sobre cánceres epiteliales
RESUMEN El melanoma es uno de los cánceres epiteliales cuya incidencia más ha aumentado en los últimos 30 años. Su alta resistencia a las terapias convencionales y su gran capacidad para producir metástasis hacen del melanoma uno de los cánceres con peor pronóstico. Otro tipo de cáncer epitelial, el cáncer de mama, es el segundo cáncer más común en todo el mundo. El tratamiento sistémico del cáncer de mama incluye quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal e inmunoterapia. Se han hecho muchos esfuerzos para desarrollar nuevas terapias, más eficaces que las que se utilizan en la actualidad, para combatir a estos dos tipos de cánceres epiteliales. En oncología clínica, un número significativo de fármacos comercializados derivan de fuentes naturales. En este contexto, el objetivo principal de esta tesis fue la identificación de biomoléculas activas, a partir de fuentes naturales, capaces de inducir apoptosis en células de melanoma y cáncer de mama, lo que podría ayudar a desarrollar nuevas terapias. Un objetivo secundario fue el desarrollo de combinaciones de fármacos que mejoraran la eficiencia y la respuesta al tratamiento.
Para lograr estos objetivos empleamos, como modelos experimentales, varias líneas celulares de melanoma y de cáncer de mama. Además, empleamos una batería de técnicas de biología celular (ensayos de viabilidad, apoptosis, migración; adhesión, microscopía óptica y electrónica; inmunoflorescencia, etc.), bioquímica (western blot, inmunoprecipitación de proteínas, espectrometría de masas, HPLC, FPLC para la purificación de proteínas, etc.), biología molecular (extracción de ácidos nucleicos, PCR, RT-qPCR, inmunoprecipitación de cromatina, etc.) y aplicaciones bioinformáticas [modelización molecular y acoplamiento molecular (Docking)]. Los resultados, tras el desarrollo de las citadas técnicas, se sometieron a las pruebas estadísticas apropiadas.
Nuestros resultados mostraron que la Lebeina, una desintegrina derivada del veneno de serpiente Macrovipera lebetina, inhibe la proliferación celular de las células SK-MEL-28 y LU-1205 del melanoma. Esta inhibición se asoció con la inhibición de la quinasa p-ERK 1/2. Esta desintegrina indujo apoptosis independiente de caspasas pero mediada por la proteína AIF (Apoptosis Inducing Factor) que induce las proteínas pro-apoptóticas BAX y BIM y regula negativamente a la proteína anti-apoptótica BCL-2. Hemos demostrado que el efecto de la Lebeina se produce a través de la modulación de dos proteínas que se consideran marcadores de la agresividad del melanoma, MITF y E-cadherina. Además, la Lebeina fue capaz de modular diferencialmente los niveles intracelulares de las especies reactivas del oxígeno (ROS) y del gen supresor de tumores p53.
Este estudio fue seguido por la caracterización de la Macrovipecetina, una lectina de tipo C, purificada a partir del mismo veneno y de la validación de su potencial antitumoral. Esta proteína se combinó con el cisplatino para obtener un efecto sinérgico sobre la viabilidad de las células de melanoma SK-MEL-28. Al igual que en el caso de la Lebeina, la Macrovipecetina también indujo apoptosis independiente de caspasas y mediada por la proteína AIF. Este compuesto también inhibe otros dos procesos clave en la progresión tumoral, la adhesión y la migración celular. Este efecto fue más pronunciado cuando la proteína se combinó con el cisplatino. La Macrovipecetina, sola o en combinación con el cisplatino, desencadenó la activación del factor de transcripción NF-kB e indujo la expresión de TRADD. Todos estos procesos derivaron en la acumulación de la proteína p53, un activador de las proteínas proapoptóticas BAX, BAD y BIM y un inhibidor de la expresión de la proteína anti-apoptótica BCL-2. Nuestros resultados también indicaron que la Macrovipecetina sola o en combinación con el cisplatino actúa como una molécula antioxidante, disminuyendo los niveles de ROS en las células de melanoma SK-MEL-28. Curiosamente, la proteína por sí sola o en combinación con el fármaco inhibe la adhesión de las células SK-MEL-28 en diferentes matrices extracelulares a través de la inhibición de la expresión de la integrina ?v?3. El estudio del acoplamiento molecular in silico sugirió que la Macrovipecetina establece una interacción con la integrina ?v?3 a través de su cadena ? y el motivo RGD. Estos tratamientos también bloquearon la migración de células y aumentaron la expresión de la proteína E-cadherina, que favorece un fenotipo menos invasivo en estas células.
Los tratamientos de quimioterapia convencionales contra el cáncer han mostrado importantes limitaciones, por lo que es de interés el diseño de nuevas estrategias para el tratamiento de esta patología. El ataque metabólico y a la señalización celular con combinaciones de fármacos que afecten mayoritariamente a las células tumorales supone una interesante perspectiva. Recientemente, varias líneas de investigación han demostrado que la combinación las catequinas naturales del té verde con quimioteterapias tradicionales que afectan a la señalización celular mediada por hormonas o con terapias biológicas más modernas que bloquean a los receptores de las tirosinas quinasas puede ser efectiva contra el cáncer de mama. Sin embargo, las catequinas del té presentan varias limitaciones terapéuticas relacionadas con su baja estabilidad y su limitado transporte celular, lo que afecta a su biodisponibilidad. Con el fin de evitar estos problemas, recientemente, hemos sintetizado en nuestro laboratorio derivados de las catequinas del té más estables y más biodisponibles. De todos ellos, la 3-O-3,4,5-trimetoxibenzoil-(-)-catequina (TMCG) mostró una alta capacidad antiproliferativa sobre células de cáncer de mama en cultivo que expresaban (ER+) o no (ER-) el receptor de estrógenos. Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral se ha elucidado el mecanismo molecular por el cual la combinación TMCG/dipiridamol (DIPY) induce apoptosis en diferentes líneas celulares de cáncer de mama. Una ventaja observada para este tratamiento es que parece ser independiente del estado de mutación y/o la presencia de proteínas tales como p53 o ER?, proteínas que, en cierta manera, controlan la proliferación/apoptosis de las células de cáncer de mama. Por lo tanto, podríamos estar ante un tratamiento, que bien solo o en combinación con otras drogas, podría ser usado frente a diferentes tipos de cáncer de mama. La combinación TMCG/DIPY actúa sobre dos rutas metabólicas primordiales para la supervivencia de las células cancerosas, el ciclo del ácido fólico y el ciclo de la metionina. Su acción compromete la metilación celular, inhibiendo a la mayor parte de las metilasas celulares dependientes de SAM. Así, en presencia de estos compuestos se produce una inhibición, no solo de las metilasas del ADN, sino también de las metilasas de proteínas. Por lo tanto, esta terapia constituye un ejemplo de como la inhibición simultánea de la metilación del ADN y proteínas (como el E2F1) podría constituir una estrategia atractiva para luchar contra el cáncer, y más concretamente contra el cáncer de mama.
El factor más importante para la determinación de la respuesta endocrina es la expresión de receptores hormonales ER? y ER? en las células cancerosas. Durante las últimas décadas el tamoxifeno (TAM) ha sido la terapia de elección en el manejo endocrino de la paciente con cáncer de mama metastático hormono-dependiente. Su mecanismo de acción se basa en su efecto antiestrogénico, es decir, bloquea la acción de esta hormona que estimula el desarrollo de las células tumorales. Sin embargo, no es útil en todos los canceres de mama, sino únicamente en aquellos cuyas células presentan receptores específicos para estrógenos (ER+). Los tumores de mama son heterogéneos a nivel celular y únicamente el 60% presentan receptores hormonales de este tipo. Por eso, una estrategia interesante a seguir con este tipo de tumores sería el desarrollo de drogas capaces de incrementar los niveles de los receptores hormonales para de ese modo hacerlos sensibles a las terapias con TAM. Debido a los buenos resultados obtenidos con la combinación TMCG/DIPY, decidimos probar la eficacia de esta combinación con TAM en células de cáncer de mama ER- (MDA-MB-231) con el fin de estudiar su proliferación celular. Se realizaron ensayos de proliferación celular con la combinación TMCG/DIPY/TAM frente a las líneas celulares humanas de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231. Los resultados mostraron que la combinación TMCG/DIPY/TAM provocaba una disminución del número de células viables mayor que la observada con el tratamiento individual de TAM. A continuación, estudiamos si la triple combinación TMCG/DIPY/TAM provocaba un aumento en la expresión del transcrito ER?. Para ello se realizaron ensayos de PCR convencional de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 tratada y no tratada con la triple combinación. Los resultados mostraron, como era de esperar, la ausencia del trascrito ER? en las células no tratadas mientras que en las células que se trataron con la combinación TMCG/DIPY/TAM se detectó la banda correspondiente al transcrito ER?. Este aumento en la expresión del ER? podría explicar la disminución del número de células viables con la combinación TMCG/DIPY/TAM y la inducción de apoptosis. Todos estos resultados indican que la combinación TMCG/DIPY aumenta la sensibilidad de células ER- (resistentes al TAM) al TAM.
SUMMARY Melanoma is one of the epithelial cancers which incidence has increased the most in the last 30 years. Its high resistance to conventional therapies and its great capacity to produce metastasis make melanoma one of the cancers with the worst prognosis. Another type of epithelial cancer, breast cancer, is the second most common cancer in the world. Systemic treatment of breast cancer includes chemotherapy, radiotherapy, hormonal therapy and immunotherapy. Many efforts have been made to develop new therapies, more effective than those currently used, to combat these two types of epithelial cancers. In clinical oncology, a significant number of industrialized drugs derive from natural sources. In this context, the main objective of this thesis was the identification of active biomolecules, from natural sources, capable of inducing apoptosis in melanoma cells and breast cancer, which could help to develop new therapies. A secondary objective was the development of drug combinations that would improve efficiency and response to treatment.
To achieve these objectives, we used several melanoma and breast cancer cell lines as experimental models. In addition, we used several techniques, including cell biology techniques (viability assays, apoptosis, migration, adhesion, optical and electronic microscopy, immunofluorescence, etc.), biochemistry techniques (western blot, protein immunoprecipitation, mass spectrometry, HPLC, FPLC for protein purification, etc.), molecular biology techniques (nucleic acid extraction, PCR, RT-qPCR, chromatin immunoprecipitation, etc.) and bioinformatic applications [molecular modeling and molecular coupling (Docking)]. The results were subjected to appropriate statistical tests after the development of the mentioned techniques.
Our results showed that Lebein, a disintegrin derived from the snake venom Macrovipera lebetina, inhibits the cell proliferation of melanoma SK-MEL-28 and LU-1205 cells. This inhibition was associated with the inhibition of p-ERK 1/2 kinase. This disintegrin induced apoptosis independently of caspases mediated by the protein AIF (Apoptosis Inducing Factor) which is in turn, upregulated the pro-apoptotic proteins BAX and BIM and downregulated the anti-apoptotic protein BCL-2. We have shown that the effect of Lebein occurs through the modulation of two proteins that are considered markers of melanoma aggressiveness, MITF and E-cadherin. In addition, Lebein was able to differentially modulate the intracellular levels of the reactive oxygen species (ROS) independently of the p53 tumor suppressor gene status.
This study was followed by the characterization of Macrovipecetin, a type C lectin, purified from the same venom and the validation of its antitumor potential. This protein was combined with cisplatin to obtain a synergistic effect on the viability of SK-MEL-28 melanoma cells. As in the case of Lebein, Macrovipecetin also induced caspase-independent apoptosis mediated by the AIF protein. This compound also inhibits two other key processes in tumor progression, adhesion and cell migration. This effect was more pronounced when the protein was combined with cisplatin. Macrovipecetin, alone or in combination with cisplatin, triggered the activation of the transcription factor NF-kB and induced the expression of TRADD. All these processes led to the accumulation of the p53 protein, an activator of the proapoptotic proteins BAX, BAD and BIM and an inhibitor of the expression of the anti-apoptotic protein BCL-2. Our results also indicated that Macrovipecetin alone or in combination with cisplatin acts as an antioxidant molecule, decreasing ROS levels in SK-MEL-28 melanoma cells. Interestingly, the protein alone or in combination with the drug inhibits the adhesion of SK-MEL-28 cells in different extracellular matrices through the inhibition of the expression of integrin ?v?3. The in silico study suggested that Macrovipecetin establishes an interaction with integrin ?v?3 through its only ? chain and the RGD motif. These treatments also blocked the migration of cells and increased the expression of the E-cadherin protein, which favors a less invasive phenotype in these cells.
The treatments of conventional chemotherapy against cancer have shown important limitations, so it is of interest to design new strategies for the treatment of this pathology. Metabolic attack and cell signaling with combinations of drugs that mainly affect tumor cells is an interesting perspective. Recently, several lines of research demonstrated that combining the natural catechins of green tea with traditional chemotherapies that affect hormone-mediated cell signaling or with more modern biological therapies that block tyrosine kinase receptors may be more effective against cancer of breast. However, tea catechins have several therapeutic limitations related to their low stability and limited cellular transport, which affects their bioavailability. In order to avoid these problems, we have recently synthesized in our laboratory derivatives of the most stable and bioavailable tea catechins. Of all of them, 3-O-3,4,5-trimethoxybenzoyl - (-) - catechin (TMCG) showed a high antiproliferative capacity on breast cancer cells in culture expressing (ER +) or not (ER-) the estrogen receptor. During the development of this Doctoral Thesis, the molecular mechanism by which the TMCG / dipyridamole combination (DIPY) induces apoptosis in different breast cancer cell lines has been elucidated. An observed advantage for this treatment is that it appears to be independent of the mutation status and / or the presence of proteins such as p53 or ER?, proteins which, in some way, control the proliferation / apoptosis of breast cancer cells. Therefore, we could be faced with a treatment which, either alone or in combination with other drugs, could be used against different types of breast cancer. The combination TMCG / DIPY acts on two metabolic pathways primordial for the survival of cancer cells, the folic acid cycle and the methionine cycle. Its action compromises cellular methylation, inhibiting most of the SAM-dependent cellular methylases. Thus, in the presence of these compounds there is an inhibition, not only of DNA methylases, but also of protein methylases. Therefore, this therapy is an example of how simultaneous inhibition of DNA methylation and proteins (such as E2F1) could be an attractive strategy against cancer, and more specifically against breast cancer.
The most important factor for the determination of the endocrine response is the expression of ER? and ER? hormone receptors in cancer cells. During the last decades, tamoxifen (TAM) has been the therapy of choice in the endocrine management of the patient with hormone-dependent metastatic breast cancer. Its mechanism of action is based on its anti-estrogenic effect, which is, the blocking of this hormone action which stimulates the development of tumor cells. However, it is not useful in all breast cancers, but only in cells having specific estrogen receptors (ER +). Breast tumors are heterogeneous at the cellular level and only 60% present hormonal receptors of this type. Therefore, an interesting strategy to follow with this type of tumor would be the development of drugs capable of increasing the levels of hormone receptors in order to make them sensitive to TAM therapies. Due to the good results obtained with the TMCG / DIPY combination, we decided to test the efficacy of this combination with TAM in breast cancer cells ER- (MDA-MB-231) in order to study its cell proliferation. Cell proliferation assays were performed with the TMCG / DIPY / TAM combination against human breast adenocarcinoma cell lines MDA-MB-231. The results showed that the combination TMCG / DIPY / TAM decreased the number of viable cells greater than that observed with the individual treatment with TAM. Then, we studied whether the triple combination TMCG / DIPY / TAM caused an increase in the expression of the ER? transcript. For this, conventional PCR assays of the breast cancer cell line MDA-MB-231 treated and not treated with the triple combination were performed. The results showed, as expected, the absence of the ER? transcript in the untreated cells while in the cells were treated with the TMCG / DIPY / TAM combination, the band corresponding to the ER? transcript was detected. This increase in ER? expression could explain the decrease in the number of viable cells with the combination TMCG / DIPY / TAM and the induction of apoptosis. All these results indicate that the TMCG / DIPY combination increases the sensitivity of ER- (TAM-resistant) cells to TAM.
