Resumen de Epidemiologia de les rickettsiosis del grup de les febres tacadesa catalunya. Estudi especific de la rickttsia massialiae bar 29. Eficàcia de les técniques diagnosticades

Isabel Sanfeliu Sala

• Antecedentes. Las rickettsiosis conocidas desde hace décadas, han pasado a ser consideradas enfermedades emergentes en los últimos años. La Fiebre Botonosa "Mediterránea (FBM) es una de les rickettslosls más frecuentes en nuestra área geográfica. La especie R. conorli ha sido considerada su principal agente etiológico. !.as técnicas de cultivo Shell-vial y de PCR han permitido identificar nuevas cepas de rickéttsias. En Catalunya, en el año 1996 la identificación de una nueva cepa, denominada en un principio MTU5 y posteriormente Rickettsia massiliae Bar 29 (grupo massiliae) en garrapatas capturadas en diferentes áreas, hizo pensar en su posible rol como agente etiológico de la FBM.En este sentido, algunos autores sugirieron la posibilidad de que un indeterminado porcentaje -de casos diagnosticados de FBM estuviesen causados, en realidad, por Bar 29.

  Hi.pótesis. la nueva especie de Rickettsia Bar 29 (Bar 29) aislada de garrapatas en nuestra área tiene poder patógeno. Esta nueva especie es un agente etiológico de la FBM en nuestra área y podría marcar algunos aspectos diferenciales tanto desde el punto de vista ep1dem1ológlco como clínlco. l.as técnicas serológicas, el cultivo Shell­vial y la técnica de PCR son útiles para su diagnóstico.

  -Objetivos. El objetivo -general de este trabajo ha sido -realizar un -estlld-io epidemiológico de la presencia de la infección por Rickettsia Bar 29 en humanos, reservorlos y vectores en Catalunya, y evaluar la eficacia de las técnicas diagnósticas. Objetivos más concretos: 1. Estimar la prevalencia de anticuerpos frente a Bar 29 en poblaciones humanas de nuestra área geográfica del Valles Occidental. Detectar 1a posible infección subclínica y relacionarla con diversos factores como el nivel social, el hábitat, la edad, el contacto con animales y hábitos .personales.

  2. Detectar las posibles reacciones cruzadas de R. massilae Bar 29 con R. conorii.

  3. Conocer el nivel de anticuerpos frente Bar 29 de los pacientes afectados de FBM. Aplicar la técnica de inmunofluorescencia indirecta (MIF) y Western inmunoblot para identificar especies.

  4. Alslar Rlck-ettsias mediant-e cultivo -en Shell-vial a partir de muestras de sangre de pacientes e identificación por PCR de las cepas rickettsiales.

  5. Estudiar la presencia de R. conoril y R. massiliae Bar 29 en animales del ciclo silvestre y doméstico y vectores en Catalunya.

  Metodologla. Estudios de seroprevalencia en humanos frente a Bar 29 por lnmunofluorescencía indirecta (Mlf). Detección de Bar 29 por MIF y Western inmunoblot, cultivo Shell-vial y PCR en pacientes con sospecha de FBM y estudios por MIF en reservarios animales. Estudio en vectores por PCR y por la técnica de Tick­borne Bacteria Flow Chip (Master Diagnóstica).

  Resultados. En el estudio de seroprevalencia frente a Rickettsia Bar 29, se ha hallado una prevalencia del 8,5% frente a Bar 29. La asociación entre Bar 29 y el contacto con perros ha sido estadísticamente significativa (p= 0.018, 0R 3.59 01.29-10.050). También se ha observado una asociación entre seropositividad y la edad, siendo más elevada entre el grupo de 45-64 años p= 0.028.

  En el estudio de reacciones cruzadas con R. conorii. Diez sueros han presentado sólo anticuerpos frente a Bar 29, 4 sueros han reaccionado al mismo título frente a las dos, dos presentaron títulos más altos frente a Bar 29 y otros dos frente a R. conorii.

  en el primer estudio de Bar 29 en pacientes de 15 sueros estudiados frente a R. conorll v Bar 2.9 5 sueros han oresentado títulos frente Bar 29 suoeriores a R. conoril y la especificidad de las reacciones se ha confirmado por inmunoblot en dos de ellos. En .un .estudio posterior .con 13.6 sueros de pacientes con sospecha de FBM se han encontrado 53 sueros positivos al menos a uno de los dos microrganismos, 40 sueros han presentado anticuerpos frente a los dos, 12 sueros con títulos superiores a Bar29 y dos casos sólo presentaban anticuerpos frente a Bar 29.

  En cuanto al cultivo de muestras por la técnica de Shell-vial. Durante el período 1994- 2003, -se hao estudiado 59 pacientes. Se han obtenido 5 cultivos positivos por "SheH vial", durante el proceso se han contaminado 4 y se ha identificado una cepa como R. conorii. Se ha procedido al rascado de los cubreobjetos del Shell vial revelados y contaminados y hemos obtenido PCRs positivas para Rickettsia en todos los casos, el posterior estudio de RFLP nos ha confirmado las cepas como R. conorii. A la vez de uno de 1os pacientes se ha sembrado toda la sangre en 17 Shetls vials, 4 de ettos han sido positivos, 6 dudosos, siendo los demás negativos. Se ha procedido al cultivo en botellas y a los 7 días han sido todos positivos. La posterior identificación por PCR­RFLP nos ha identificado la cepa como R. conorii.

  El estudio en reservorios animales, del ciclo silvestre (zorros) y del doméstico (ovejas, cabras y bovidos), se han recogido muestras de sangre de 135 zorros, 138 vacas bravas, 137 ovejas y 98 cabras. De les 135 muestras de zorros se han encontrado 62 muestras (45.-9%) con aanticuerpos frente a R. massiliae Bar29 y un 25.1% (34 muestras) a R. conorii. En cuanto a los reservorios domésticos, del estudio en vacas se han encontrado 55 muestras (39,8%) con anticuerpos frente a R. massiliae Bar 29 y un 26% a R. conorii. En las ovejas un 20.4% (28/137) han sido positivas a Rickettsia Bar 29 y un 24,8% a R. conorii. Finalmente, las cabras un 26.5% (26/98) han sido positivas a Rickettsia Bar 29 y un 39. 7% a R. conorii.

  De los zorros se han recogido 137 garrapatas del Rhipicephalus sanguineus complex. Se -han analizado -por la técnk:a de PCR -0mpA y se ha detectado ONA de -Rickettsia en 80 garrapatas (58.3 %). Se ha procedido a la su secuenciación, 77 de ellas han dado R. massillae Bar 291 tres R. aeschflmannfl, R. conorll no ha sido identiflcada en ningún caso. Posteriormente se han analizado las 137 garrapatas por la técnica Tick-borne Bacteria Flow Chip (Master Diagnóstica). El 83.2 % (114/137) han resultado positivas a ruckettsla por esta técnica. Una vez secuenciadas, 107 se han identificado como R. massllíae Bar 29, 3 como R. aeschiimannii, una como R. slovaca y en las otras tres sólo se llegó a R.lckettsla spp .. Todas las muestras positivas por ompA también lo fueron por esta técnica. Se detectaron además 21 coinfecciones con Bartonella spp., 12 con Borrella spp. y tres con las dos a la vez. Se han recogido además 117 garrapatas en fase libre mediante el proceso de manteo que se han identificado dentro del grupo R. sanguineus. Se han analizado por la técnica de Tick-borne Bacteria Flow Chip. B 94% (U0/117) -de ellas han resultado posit-ivas a Riclrettsia tlei grupo de les fiebres manchadas. Se han podido secuenciar 85 de ellas, 71 como R. massiliae Bar 29 y 14 con Rickettsla spp. detectándose en 23 garrapatas coinfección con Borrella spp. Conclusiones 1. La población humana sana de nuestra área, presenta una seroprevalencia frente a R. mass1llae Bar 29 del 8.5%. Ocho sueros (3.8%) han presentado reacciones cruzadas frente a R. conorll.

  2. En el pr􀆈mer estudio con 15 pacientes, 5 de ellos han presentado títulos superiores a R. massiliae Bar 29 respecto a R. conorii. El inmunoblot nos ha confirmado una respuesta especifica frente a Bar 29 en dos de los sueros al reaccionar con las proteínas de alto peso molecular. Los dos pacientes han presentado más de una picadura o múltiples escaras.

  Oel segundo estudio con 13{i sueros, 14 de ellos tian presentado títulos superiores a Bar 29 dos de ellos sólo han presentado anticuerpos Frente a Bar 29.

  De lo.s resultados de Jos dos estudios se puede deducir que un número de casos de FBM en nuestros pacientes, podrían estar causados por R. masslllae Bar 2. 3. EI cultivo Shell-vlal es un método fácil y recomendable para obtener cepas de rlckéttslas a través de la sangre de pacientes. Su senslbllldad es baja, pero se puede Incrementar realizando PCR de los cultivos o bien cultivando toda la sangre extraída de 􀆬os -pacientes.

  4. Mediante el cultivo "Shell-vial" podemos llegar a través de la PCR y secuenciación a identificar las diferentes especies de Rickettsias de les cepas aisladas.

  5. En los zorros se ha encontrado una seroprevalencia del 45.9% frente a R. massiliae Bar 29 y una seroprevalencia a R. conorii del 25.1%. un 20.7 % de los sueros han reaccionado frente a ios dos antígenos.

  6. La seroprevalencia a R. conorll ha sJdo del 26% en las vacas, 24.8 % en las ovejas y 1m 39.7% en las cabras. La seropr.evalencia a R. massU!ae Bar 29 ha sido del 39.B %en las vacas, 20.4% en las ovejas y un 26.5% en las cabras.

  7. Un 83.2 % (114/137) de las garrapatas extraídas de los zorros han resultado positivas por PCR a Rickettsia. La secuenclación ha identificado a 107 (93,8%) como 8. fl 94% (11-0/117} de las garrapatas de ma-nteo han sido positivas a Rickettsia del grupo de les fiebres manchadas. Setenta y una de las 85 (83.5%) que se han secuenciado se han identificado como R. massiliae Bar 29.

  9. La técnica Tick-Borne Bacteria Flow Chip nos ha incrementado notablemente la senslbilldad respecto a la PCR omPA para la detección de Rlckettslas en los vectores.