Avaluació dels efectes dels factors ambientals en el metaboloma de la daphnia magna mitjançant mètodes cromatogràfics i quimiomètrics
- Autores: Elba Garreta Lara
- Directores de la Tesis: Romà Tauler Ferré (dir. tes.), Silvia Lacorte Bruguera (dir. tes.), María Teresa Galcerán i Huguet (tut. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Rosa Maria Marcé Recasens (presid.), Carmen Bedia Girbés (secret.), Cristian Gómez Canela (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química Analítica y Medio Ambiente por la Universidad de Barcelona
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
Durant el segle XX i principis del XXI, el clima i els ecosistemes han patit canvis apreciables com a conseqüència directa de l’activitat humana. Els impactes naturals i antropogènics juntament amb els efectes del canvi climàtic han esdevingut un problema urgent per resoldre. Aquestes alteracions químiques i físiques de l’entorn i dels ecosistemes aquàtics produeixen canvis en els sistemes metabòlics dels organismes vius. En el camp de la metabolòmica ambiental, l’estudi i l’anàlisi d’aquests canvis proporciona informació significativa sobre les respostes biològiques a aquestes alteracions ambientals. En aquest context, els enfocaments basats en l’espectrometria de masses (MS) han estat clau en el ràpid desenvolupament de les tecnologies metabolòmiques, ja que han proporcionat un nou enfocament per investigar i avaluar els efectes dels productes químics i altres factors abiòtics en la complexitat molecular dels sistemes biològics. En aquest context, aquesta Tesi s’ha centrat en el desenvolupament de mètodes analítics de metabolòmica dirigida i no dirigida basats en tècniques de separació acoblades a la MS, com per exemple la cromatografia de gasos i la cromatografia de líquids (GC-MS i LC-MS, respectivament), i en l’aplicació dels mètodes quimiomètrics per tal de determinar, identificar i avaluar els canvis produïts en el metaboloma de la D. magna a causa de l’exposició a un estressant ambiental.
Per una banda, s’han desenvolupat i optimitzat els mètodes analítics de GC-MS i cromatografia de gasos bidimensional acoblada a l’espectrometria de masses (GCxGCMS) i de tractament de les dades multivariants per a estudis de metabolòmica no dirigida. En concret, s’han optimitzat les condicions experimentals d’extracció i de derivatització i s’han avaluat diferents tipus de columnes cromatogràfiques per la determinació dels metabòlits presents en la D. magna. Per altra banda, s’han presentat dues aproximacions per la compressió dels grans conjunts de dades que es generen per tal d’extreure la informació biològica rellevant i facilitar-ne la seva interpretació.
D’aquesta manera, s’ha demostrat la gran eficàcia i la robustesa del mètode quimiomètric de resolució multivariant de corbes per mínims quadrats alternats (MCRALS) per la resolució dels perfils d’elució i dels espectres de masses dels metabòlits presents en les mostres de metabolòmica de D. magna analitzades mitjançant GC-MS i GCxGC-MS. A més, s’han avaluat els efectes de les exposicions a diferents factors abiòtics com la salinitat, la temperatura i la hipòxia en el metaboloma de la D. magna.
L’aplicació del disseny experimental per a l’estudi dels factors d’exposició ha permès avaluar les possibles interaccions entre els diferents tractaments i llurs combinacions.
Els resultats han demostrat la gran influència de la salinitat en el perfil metabolòmic de la D. magna, la qual està relacionada amb el metabolisme dels aminoàcids, de les proteïnes, dels sucres, dels àcids grassos i amb el metabolisme energètic, com el cicle de Krebs.
Finalment, s’han presentat els resultats de l’avaluació de les alteracions de diversos contaminants ambientals mitjançant les estratègies dirigida i no dirigida per a l’estudi del metaboloma de la D. magna. L’anàlisi dirigida ha permès la quantificació absoluta dels nivells de les oxilipines i l’avaluació dels efectes de la fluoxetina, el diazepam i la carbamazepina en el metaboloma de la D. magna. Els resultats han demostrat una influència de les exposicions als productes farmacèutics en els nivells de diversos derivats de l’àcid araquidònic, l’àcid linoleic, l’àcid a-linoleic i àcid eicosapentaenoic. Per altra banda, s’ha realitzat una caracterització exhaustiva dels efectes del bisfenol A en els perfils metabolòmics de la D. magna mitjançant la combinació de les estratègies dirigida i no dirigida. S’ha realitzat una interpretació detallada i quantitativa dels metabòlits afectats per l’exposició a bisfenol A mitjançant l’estratègia dirigida. Mentre que, en l’anàlisi no dirigida s’ha aplicat la compressió de les dades mitjançant la selecció de les regions d’interès (ROIs) i la resolució mitjançant MCR-ALS a causa de la complexitat de les dades obtingudes per cromatografia de líquids acoblada a l’espectrometria de masses d’alta resolució (LC-HRMS). La interpretació biològica de les alteracions produïdes a causa de l’exposició al bisfenol A estan relacionades amb el metabolisme del carboni i amb una disminució dels nivells de glutamat, el qual juga un paper central en el metabolisme dels aminoàcids.
Since the last century, climate and ecosystems have undergone significant changes as a direct consequence of human activity. Natural and anthropogenic impacts together with the effects of climate change have become an urgent problem to solve. These chemical and physical alterations of the environment and aquatic ecosystem cause changes in the metabolic systems of living organisms. In environmental metabolomics, the study of these changes provides significant information on biological responses to these environmental alterations. In this context, methods based on mass spectrometry (MS) have provided a new approach to investigate and evaluate the effects of chemical products and other abiotic factors on the molecular complexity of biological systems.
This Thesis has focused on the development of analytical methods based on separation techniques coupled to MS, such as gas chromatography and liquid chromatography (GCMS and LC-MS, respectively), and in the application of chemometric methods in order to determine, identify and evaluate changes produced in D. magna metabolome due to the exposure to an environmental stressor.
For non-targeted metabolomic studies analytical methods using GC-MS and of twodimensional gas chromatography coupled to mass spectrometry (GCxGC-MS) have been developed and optimized. In particular, extraction and derivatization conditions have been optimized and different types of chromatographic columns have been evaluated to determine the metabolites present in D. magna. On the other hand, two approaches have been presented for compression of the large data sets generated in order to extract the relevant biological information and to facilitate its interpretation. In this way, it has been demonstrated the high efficiency and robustness of the multivariate curve resolution by alternating least squares (MCR-ALS) method for resolution of elution and mass spectra profiles of the metabolites present in D. magna metabolomic samples analyzed using GC-MS and GCxGC-MS. In addition, the effects of exposures on different abiotic factors such as salinity, temperature and hypoxia in D. magna metabolome were evaluated. The application of the experimental design to simultaneously study the factors exposition allowed the evaluation of the possible interactions between the different treatments and their combinations. The results have shown the great influence of salinity on the metabolic profile of D. magna, which is related to the metabolism of amino acids, proteins, sugars, fatty acids and energy metabolism, such as the Krebs cycle.
Finally, the evaluation results of the alterations of several environmental pollutants have been presented by means of targeted and non-targeted metabolomics strategies for the study of D. magna metabolome. Targeted analysis has allowed the quantification of oxylipins levels and the evaluation of fluoxetine, diazepam and carbamazepine effects on the metabolome of D. magna. The results have shown an influence on the exposures to pharmaceutical products at the levels of various derivatives of arachidonic acid, linoleic acid, a-linoleic acid and eicosapentaenoic acid. Moreover, an exhaustive characterization of the effects of bisphenol A in the metabolic profiles of D. magna was evaluated by combining targeted and non-targeted approaches. A detailed and quantitative interpretation of the metabolites affected by bisphenol A exposures has been performed using targeted analysis. Meanwhile, the use of ROIMCR data treatment approach (data compression by the search of regions of interest (ROI) and data resolution using MCR-ALS) in non-targeted strategy was performed to resolve complex data sets obtained by liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The biological interpretation of the alterations caused by bisphenol A exposure are related to carbon metabolism and with a decrease in glutamate levels, which plays a central role in amino acids metabolism.
