Identificación, localización y función de las acuaporinas en el espermatozoide equino y su relación con la criopreservación
- Autores: Sebastian Bonilla Correal
- Directores de la Tesis: Marc Yeste Oliveras (dir. tes.), Jordi Miró Roig (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Sergi Bonet (presid.), Teresa Rigau i Mas (secret.), Graça Maria Ferreira Dias (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Medicina y Sanidad Animales por la Universidad Autónoma de Barcelona
- Materias:
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- Resumen
La criopreservación es una técnica que ha ido avanzando en los últimos años, buscando obtener mejores resultados de fecundación. Esta técnica está asociada a tres factores relevantes para la presente tesis doctoral: en primer lugar, a la aparición de técnicas de inseminación artificial como la IA uterina profunda que solo requiere de una pequeña cantidad de células espermáticas; en segundo lugar a la utilización de crioprotectores distintos al glicerol, lo que permite una mejor criosupervivencia del esperma; y finalmente, al establecimiento de nuevas técnicas de selección espermática que aumentan la calidad del semen congelado.
El espermatozoide maduro es una célula muy permeable al agua. Su membrana plasmática posee las Acuaporinas, unos canales selectivos para el paso de agua y otras sustancias como los crioprotectores. La existencia y función de estas proteínas han sido estudiadas en espermatozoides de diferentes mamíferos como el humano, el perro, el cerdo y el toro, pero poco en el caballo.
El primer objetivo de la presente tesis doctoral fue determinar la presencia de las acuaporinas AQP3, AQP7 y AQP11 en el espermatozoide equino mediante la técnica de Western Blot, así como establecer la relación entre estas tres acuaporinas y la calidad espermática o la criotolerancia de eyaculados de caballo. El segundo objetivo fue determinar la localización de AQP3, AQP7 y AQP11 en el espermatozoide de caballo y examinar los cambios en su localización en respuesta a la criopreservación. Y finalmente el tercer objetivo de la tesis consistió en evaluar la funcionalidad de estas acuaporinas usando tres diferentes inhibidores (Acetazolamida, Floretina y Propandiol) con el propósito de observar cambios en la motilidad utilizando el sistema CASA y cambios en la supervivencia y funcionalidad espermática usando la citometría de flujo.
Los resultados del método Western Blot demostraron la presencia de estas tres proteínas en la membrana del espermatozoide equino. Las acuaporinas se presentaron en dos tipos de bandas de pesos moleculares de 60 kDa y 30 kDa, siendo más clara la primera que la segunda en todos los casos. Asimismo, se observó que el contenido relativo de la AQP7 en el espermatozoide de caballo no presentaba diferencias significativas entre buenos (GFE) y malos congeladores (PFE). Para la AQP3 y la AQP11, el contenido relativo en la banda de 60 kDa era significativamente mayor en el grupo de buenos que en el de malos congeladores. Por el contrario, el contenido relativo de la banda de 30 kDa de la AQP11 era más alto en los PFE en comparación con los GFE.
En relación al segundo objetivo, se identificó la localización de estas tres acuaporinas. Se encontró que la AQP3 y la AQP7 en el semen fresco están localizadas en la pieza intermedia, mientras que la AQP11 se encuentra en la pieza principal y en la región post-acrosómica de los espermatozoides de caballo. Una vez realizado el proceso de criopreservación, se observó que esta localización se modificaba en dos de ellas: AQP3 y AQP11.
Finalmente, se pudo observar que la inhibición de las acuaporinas estudiadas depende de la especificidad del inhibidor para cada una de ellas, y de sus efectos colaterales en otras proteínas de la membrana del espermatozoide. En este sentido, los resultados de la Acetazolamida (AC), que inhibe principalmente las AQP ortodoxas, sugirieron que que estas proteínas no están involucradas en la respuesta a los cambios de osmolaridad producidos durante la criopreservación. Por el contrario, los experimentos con la Floretina (PHL), que inhibe las acuagliceroporinas, indicaron juegan un papel crucial en la regulación del volumen celular durante la criopreservación. Finalmente, se observó que el Propandiol (PDO) mantenía mejor la calidad espermática después de la descongelación, indicando así su potencial como agente crioprotector.
Así pues, se puede concluir que las acuaporinas se encuentran en los espermatozoides de caballo, donde juegan un papel fundamental en cuanto a su capacidad de resistencia frente a los protocolos de congelación y descongelación. Todos estos resultados contribuyen a incrementar nuestro conocimiento acerca del papel de estos canales de agua en la fisiología y criopreservación de los espermatozoides equinos, pudiendo tener así implicaciones prácticas como su uso como marcadores de congelabilidad y la selección de los eyaculados aptos para la criopreservación.
