Resumen de New insights into g¿12/g¿13 signaling pathways
Els receptors acoblats a proteïnes G (GPCRs) són els encarregats de transmetre els senyals extracel¿lulars a l¿interior cel¿lular i promoure així un elevat nombre de processos biològics. Les proteïnes G heterotrimèriques són les encarregades d¿interaccionar amb els GPCRs i transmetre les senyals. Les proteïnes G heterotrimèriques estan formades per les subunitats ¿, ¿ i ¿. La unió del lligand al GPCR fa que aquest indueixi l¿intercanvi de GDP a GTP en la subunitat ¿, provocant l¿activació i la dissociació del complex ¿¿. Les subunitats ¿ de les proteïnes G es divideixen en quatre famílies: G¿i, G¿s, G¿q, G¿12. La subfamília G12 està formada pels membres G¿12 i G¿13. Aquesta subfamília està implicada en diversos processos fisiològics com per exemple en el desenvolupament embrionari, el creixement cel¿lular, la migració cel¿lular, els processos d¿angiogènesi i l¿apoptosi. Les proteïnes G¿12 i G¿13 poden interaccionar i transmetre els senyals a un ampli ventall de proteïnes efectores. Una de les vies de senyalització efectores de la subfamília G12 més estudiada és la família de les RhoGTPases. La família de les RhoGTPases forma part de la súper família Ras de petites proteïnes que uneixen GTP. Les RhoGTPases estan implicades en una gran diversitat de funcions, com per exemple desenvolupament, polaritat, migració, desenvolupament neuronal, divisió cel¿lular i adhesió. La família de les RhoGTPases està formada per les subfamílies Rho, Rac i Cdc42, les quals poden transitar entre un estat actiu, unides a GTP, i un estat inactiu, unides a GDP. L¿activació de les proteïnes Rho està regulada per les proteïnes intercanviadores de nucleòtids de guanina (RhoGEF). Les RhoGEFs pertanyen a la familia Dbl, i es caracteritzen per la presencia dels dominis DH-PH. El domini DH és el responsable d¿activar les RhoGTPases, mentre que el domini PH és fonamental per a la completa activitat del domini DH. En mamífers, existeixen tres tipus de proteïnes RhoGEFs que s¿encarreguen d¿enllaçar la senyalització procedent de les proteïnes G¿12 i G¿13 a l¿activació de RhoA. Aquestes son: p115RhoGEF, PDZ-RhoGEF i LARG. Aquestes RhoGEFs comparteixen la presencia d¿un domini encarregat de regular la senyalització de les proteïnes G, el qual s¿anomena domini RH, i per tant, aquests membres s¿anomenen RH-RhoGEFs. Un altre membre de la família de les proteïnes RhoGEFs és la p190RhoGEF. Aquesta proteïna s¿ha vist que indueix l¿activació de RhoA, però en canvi no s¿ha descrit que la seva activitat estigui induïda per proteïnes G. La proteïna p190RhoGEF s¿ha descrit que interacciona amb la FAK (quinasa d¿adhesió focal) i que està implicada en processos de formació d¿adhesions i migració cel¿lular induïts per integrines. A més a més, l¿activitat de p190RhoGEF també s¿ha vist afectada per l¿activació de GPCRs. Així, s¿ha descrit que la gastrina, mitjançant el receptor CCK2 indueix l¿activació de p190RhoGEF. p190RhoGEF juga un paper fonamental en la localització de les FAK als llocs de formació de les adhesions focals i en la fosforilació de paxilina. De forma important, s¿ha demostrat que, en ratolins, la p190RhoGEF promou el creixement tumoral de càncer de colon i la invasió de teixits adjacents. A més, s¿ha descrit que l¿expressió de p190RhoGEF està augmentada en mostres de colon humà. D¿aquesta manera, amb les observacions obtingudes fins al moment, sembla important descobrir els mecanismes que promouen l¿activació d¿aquesta proteïna.
En els primers estadis d¿aquesta tesi, es va introduir la proteïna GFP dintre de la seqüència de la proteïna G¿12 i la proteïna G¿13. Després de tot un seguit d¿intents, es va veure que era necessari incloure el residus Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser als extrems de la proteïna GFP per tal d¿obtenir una proteïna de fusió funcionalment activa. A més, es va determinar que la posició òptima per introduir la proteïna GFP dintre de la seqüència de la proteïna G¿12 era entre els aminoàcids prolina 139 i valina 140. En el cas de la G¿13, la proteïna GFP es va introduir entre els aminoàcids metionina 136 i valina 137, i es va poder confirmar que era necessari mutar la metionina 136 a prolina per tal d¿obtenir una proteïna de fusió funcionalment activa.
Durant el transcurs d¿aquesta tesi s¿ha dut a terme una col¿laboració amb un altre projecte d¿investigació que ha resultat amb la publicació d¿un article. Aquest projecte consistia en determinar com es veu afectada la fosforilació i l¿activitat de la proteïna catenina p120 en unir-se a la proteïna G¿12. Les conclusions més rellevants que se¿n van extreure es detallen a continuació. Per una banda, la proteïna G¿12 és capaç d¿inhibir l¿efecte supressor que la catenina p120 exerceix sobre RhoA per un mecanisme dependent de l¿activació de RhoA. Per altra banda, es va observar que l¿expressió de la proteïna G¿12 inhibeix específicament la fosforilació de catenina p120 induïda per Src, però no la fosforilació del receptor EGF. En aquest sentit, els indicis semblen indicar que aquesta modulació de la fosforilació que la proteïna G¿12 exerceix sobre la catenina p120 es produeix a través d¿un mecanisme independent de l¿activació de RhoA. Amb la finalitat de descobrir el mecanisme a través del qual la catenina p120 inhibeix RhoA, vam descobrir que les subunitats ¿ de les proteïnes G podien interaccionar amb un nou membre i que per tant, aquest podia ser un nou efector de la senyalització a través de les proteïnes G. Des d¿aquest moment, aquest va resultar ser en el principal objectiu d¿aquesta tesi. Durant el transcurs d¿aquest treball, hem identificat una nova proteïna, p190RhoGEF, la qual s¿encarrega de transmetre la senyalització induïda per la proteïna G¿13. Fins llavors, la proteïna p190RhoGEF no s¿havia identificat com a un efector de les proteïnes G hetorotrimèriques, ja que semblava que no contingués el domini RH d¿interacció amb aquestes proteïnes. Els nostres estudis han permès determinar que la p190RhoGEF conté una regió amb certa homologia als dominis RH en el seu extrem C-terminal, i que hem anomenat domini ¿RH-like¿. Experiments d¿immunoprecipitació han demostrat que aquest domini ¿RH-like¿ de la p190RhoGEF és responsable de la interacció amb les proteïnes G¿13 i G¿q. No obstant, sembla que la proteïna G¿13 també pugui unir-se a la regió N-terminal de la p190RhoGEF, la qual conté els dominis DH-PH. Els estudis funcionals han permès descriure que la interacció entre la proteïna G¿13 o G¿q i la proteïna p190RhoGEF indueix l¿activació de RhoA. Per tal demostrar la participació de la proteïna p190RhoGEF en la via de senyalització de la proteïna G¿13, es va expressar un mutant de la p190RhoGEF consistent exclusivament amb la regió C-terminal, sense la presència del domini catalític DH-PH. Així, es va veure que aquest mutant inhibia la senyalització induïda per G¿13 i també l¿activació de RhoA induïda per LPA. Tenint en compte que les RH-RhoGEF regulades per la família G12 descrites fins ara són translocades a la membrana plasmàtica com a resultat de la seva activació, vam estudiar si aquest efecte també es donava en el cas de la p190RhoGEF. Els resultat obtinguts demostren que p190RhoGEF també es transloca a la membrana plasmàtica en resposta a l¿activació de G¿13.
Per altra banda, en aquests estudis es va analitzar la importància de la proteïna G¿13 en la via de senyalització de la gastrina. La gastrina és una hormona relacionada amb la proliferació cel¿lular i transformació oncogènica. A més, s¿ha demostrat que la gastrina promou l¿activació de la p190RhoGEF, la fosforilació de paxilina, la formació d¿adhesions focals i la migració cel¿lular. D¿aquesta manera, per tal d¿estudiar la implicació de la proteïna G¿13 en la via de senyalització de la gastrina, es va inhibir l¿expressió de la proteïna G¿13 endògena en cèl¿lules de càncer de colon humanes (DLD-1) mitjançant un sistema d¿RNA interferent, i es va estudiar si l¿hormona gastrina era capaç de promoure algunes de les seves funcions. Els resultats obtinguts van demostrar que, en absència de la proteïna G¿13, gastrina no era capaç de promoure l¿activació de RhoA ni la fosforilació de la paxilina. Un altre dels efectes que es va estudiar va ser la capacitat de la migració cel¿lular induïda per gastrina. Els resultats obtinguts reflecteixen que les cèl¿lules que inhibeixen G¿13 migren menys que la línea salvatge, en resposta a l¿estimulació amb gastrina.
Tenint en compte que la proteïna p190RhoGEF està sobre-expressada en teixits de càncer de colon, es va intentar veure mitjançant tinció immunohistoquímica si la proteïna G¿13 també estava augmentada en aquest tipus de càncer. Conjuntament amb les mostres de colon també es van incloure altres teixits del tracte gastrointestinal com ara pàncrees, estómac i intestí prim. Amb aquests estudis es va descobrir que la proteïna G¿13 s¿expressa en unes cèl¿lules molt concretes de les illes de Langerhans al pàncrees. A més, també es va veure que la proteïna G¿13 s¿expressava en algunes cèl¿lules de la base de les glàndules de l¿estómac de ratolí. Estudis posterior van permetre determinar que la proteïna G¿13 s¿expressa específicament en cèl¿lules neuroendocrines que expressen sinaptofisina. Per tal d¿identificar el tipus de cèl¿lules neuroendocrines, es van utilitzar els marcadors somatostatina i gastrina que permeten diferenciar entre les cèl¿lules D i G, respectivament. Els assajos va permetre concloure que a l¿estómac, la proteïna G¿13 s¿expressa específicament en les cèl¿lules D que contenen somatostatina i no en les cèl¿lules G que expressen gastrina. Seguidament, es va estudiar si les proteïnes G¿13 i p190RhoGEF s¿expressaven en la mateixa subpoblació de cèl¿lules de l¿estómac. Tot i que els resultats obtinguts són força preliminars, ens suggereixen que algunes cèl¿lules que expressen p190RhoGEF, també expressen simultàniament G¿13. Per últim, els experiments realitzats en tres tipus de tumor humans de colon van concloure que l¿expressió de la proteïna G¿13 no està augmentada en aquests tipus de tumors.
