Toxicidad del cr(vi): estudio de interacciones del cromo con componentes celulares
- Autores: Andre Nuno Tavares da Costa
- Directores de la Tesis: Virtudes Moreno Martínez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2012
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: María Carmen Martins de Carvalho Alpoim (presid.), Montserrat Corbella Cordomí (secret.), Julia Lorenzo Rivera (voc.)
- Materias:
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- Resumen
En esta Tesis se describe la interacción del cromo(VI) con los componentes principales del sistema celular in vitro en términos de acumulación y reducción, y de su toxicidad. Según un principio farmacocinético, el medio de cultivo, la matriz proteica de colágeno/albúmina sérica y las células adherentes de epitelio bronquial, los componentes principales, se han considerado como compartimientos independientes capaces de interactuar con el cromo.
La acumulación y reducción de cromo se estudió determinando en el medio de cultivo la concentración total del elemento y la concentración parcial del estado de oxidación VI por Espectroscopia de Absorción Atómica y el método colorimétrico de la 1,5-Difenilcarbacida respectivamente. Se ha demostrado que la mayor parte del cromo se mantiene ¿libre¿ en el medio de cultivo con solo una pequeña cantidad acumulada en las células. La rápida reducción extracelular del cromo(VI), a cargo de la matriz y de las células, juega en contra de la acumulación de cromo en ellas. Así, un aumento en el número de células dio como resultado una reducción extracelular más rápida y una menor acumulación. Las membranas celulares podrían también estar involucradas en la reducción extracelular ya que sufren alteraciones morfológicas, visualizadas por Microscopia de Fuerzas Atómicas. En lo que respecta a la matriz, se han detectado evidencias de un mecanismo de reducción de cromo(VI) rápido y saturable ¿ por encima de la saturación la velocidad de reducción extracelular de cromo es significativamente más baja. La citotoxicidad del cromo(VI) se ha evaluado a través de la cinética del crecimiento celular determinada por recuento celular in situ al microscopio óptico. Específicamente, se ha demostrado que la expansión de la fase de aclimatación depende de la acumulación/reducción de cromo en las células, mientras que la disminución de la velocidad de crecimiento se correlaciona con la saturación del mecanismo rápido de reducción. Dado que se ha observado que el cromo(VI) altera la cinética de polimerización y la morfología de la matriz, evaluadas por Turbidimetría y Microscopia de Fuerzas Atómicas respectivamente, es posible que la ralentización de la velocidad de crecimiento celular sea una consecuencia de la alteración estructural y funcional de la matriz.
Estos resultados llaman la atención para el hecho de que algunas manifestaciones citotóxicas pueden surgir de interacciones del cromo(VI) con el entorno celular. Es conocido que la matriz extracelular, aquí mimetizada por la matriz de colágeno/albúmina sérica, y las membranas celulares actúan de forma sinérgica en la intercomunicación celular, controlando el crecimiento y la diferenciación. La interferencia persistente con este mecanismo de control podría contribuir de forma significativa en la selección de fenotipos auto-suficientes, y consecuentemente, promover el cáncer.
Se estudian a continuación las respuestas celulares a la exposición a cromo(VI) según parámetros citotoxicológicos comunes: la capacidad reductora celular, la cinética del crecimiento y la inducción de muerte por apoptosis o necrosis. Con esta información se pretende localizar la gama de concentraciones relevantes para el estudio in vitro de la carcinogénesis pulmonar inducida por cromo(VI). La capacidad reductora de las poblaciones celulares expuestas a cromo(VI) se ha cuantificado en términos de la capacidad reductora de toda la población, determinada por el método colorimétrico del MTT (Sigma®). De esta forma se ha podido estudiar sistemáticamente una amplia ventana de concentraciones de cromo(VI), desde el nivel picomolar (pM) hasta el micromolar (¿M). Principalmente, se ha demostrado que a concentraciones sub-micromolares la presencia de cromo(VI) induce un aumento de la capacidad reductora de las células. Este efecto, llamado beneficioso, está probablemente relacionado con el carácter esencial del cromo en la regulación del receptor de insulina, y por tanto, en la gestión de la glucosa. A concentraciones micromolares la presencia de cromo(VI) afecta negativamente a la capacidad reductora de las poblaciones, observándose una bajada bastante pronunciada. A través del estudio de la cinética del crecimiento celular, por recuento celular in situ en el microscopio óptico, se ha demostrado que, en una primera fase, dicho descenso se debe mayoritariamente al aumento progresivo de la duración de la fase de aclimatación. Este aumento se debe probablemente a la parada transitoria del ciclo celular y así a la activación de los mecanismos de reparación. En el intervalo de unas pocas unidades micromolares se ha detectado ya la presencia de muerte celular por apoptosis, evaluada por microscopía de fluorescencia con los marcadores de ADN Hoechst33342 y PI (Molecular Probes®). Aumentando ligeramente la concentración, la dosis de cromo(VI) origina necrosis por lo que se considera altamente letal.
Con estos resultados y teniendo en cuenta que en cualquier estudio toxicológico la dosis aplicada debe adecuarse al efecto que se pretende estudiar, se ha estipulado que la ventana de concentraciones enmarcada desde el final de la zona beneficiosa hasta el inicio de la zona letal, de 0,1 µM hasta 4 µM, es la gama de concentraciones de mayor relevancia e interés en el contexto de la carcinogénesis inducida por cromo(VI). Permite la exposición crónica de las poblaciones celulares a condiciones ¿sub/csi-no-citotóxicas¿ que inducen de forma transitoria la parada del ciclo celular. Así mismo, estará sujeta a fluctuaciones debido a los parámetros experimentales utilizados, con especial incidencia sobre la densidad celular y el momento de la adición del cromo a los sistemas.
Se caracteriza, en términos citobiológicos, histológicos, genómicos y epigenómicos, el comportamiento de poblaciones celulares expuestas crónicamente a concentraciones ¿sub/casi-no-citotóxi-cas¿ de cromo(VI). Se pretende de esta forma describir la progresión cancerígena inducida por ion metálico teniendo como base los mecanismos celulares y moleculares que sostienen su citotoxicidad.
De forma destacada, la exposición crónica de poblaciones de células no tumorales de epitelio bronquial humano (línea BEAS-2B) ha generado fenotipos ¿cancerígenos¿ caracterizados por una menor sensibilidad al cromo, supuestamente debido a fallos en los mecanismos de control del ciclo celular (evaluado por la cinética del crecimiento determinada por recuento celular in situ); por una gran heterogeneidad morfológica y del patrón de crecimiento, con pérdida de la inhibición del crecimiento por contacto (evaluada por microscopia óptica); y por la alteración del nivel de metilación del ADN genómico hacía la hipometilación (evaluado por los patrones de restricción resultantes de la digestión del ADN con una endonucleasa sensible a la metilación). Además, se ha descrito en la bibliografía que las células generadas por este modelo in vitro inducen tumores en ratas inmunodeprimidas.
Dichas células ¿cancerígenas¿ no presentan alteraciones significativas en la secuencia del ADN genómico (evaluado por el método de la amplificación aleatoria de ADN polimórfico, RAPD), no presentan niveles significativos de cromo asociado al ADN (medido por espectroscopia de absorción atómica), y se ha descrito que no presentan inestabilidad en las secuencias microsatélite (MSI), una prueba de la fidelidad de la secuencia del ADN, a la vez que albergan alteraciones numéricas y estructurales en sus cromosomas. Aunque el estado hipometilado del ADN de las células pueda contribuir a la alteración estructural de los cromosomas, de acuerdo con estudios en condiciones citotóxicas, se deben a fallos durante la mitosis. Una prueba de tales fallos es la elevada frecuencia de aberraciones celulares observada en las poblaciones expuestas crónicamente. Es interesante notar que mientras que las aberraciones celulares y la alteración del patrón de crecimiento con pérdida de la inhibición del crecimiento por contacto solo se ha observado durante el periodo de exposición al cromo(VI), por lo que parecen deberse a la interacción del cromo con componentes del sistema, la hipometilación del ADN persistió después de su eliminación, por lo que podría ser una adaptación celular a la presencia crónica de cromo(VI).
Desde un punto de vista funcional los resultados indican que en régimen de exposición crónica el cromo(VI) actúa no solo como agente transformante, debido a su cito(geno)toxicidad, sino también como agente selector de fenotipos transformados, al condicionar el microambiente celular favoreciendo por ejemplo células menos sensibles a su presencia y menos dependientes de la matriz extracelular.
Finalmente, se presentan estudios dirigidos a caracterizar químicamente la interacción del manitol con el cromo en estado de oxidación V. Se cree que esta propiedad puede tener aplicación farmacológica en el ámbito del cáncer de pulmón inducido por el cromo(VI). Dicha aplicabilidad farmacológica se ha evaluado tomando como referencia el sistema celular modelo desarrollado y caracterizado en los capítulos anteriores.
Basado en la técnica espectroscópica de la Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR) se ha determinado que durante la reacción de reducción del cromo(VI) con manitol las especies de cromo(V) producidas proceden, dependiendo de la concentración de cromo, de una reacción de comproporción entre el cromo(IV) y el cromo(VI), para concentraciones elevadas, o de la reacción del cromo(IV) con el sustrato. Probablemente la diferencia se debe a la existencia o no de dicromato en disolución, siendo que en condiciones fisiológicas, pH 7,4 y concentraciones micromolares, su presencia es poco probable. La estructura de los complejos de cromo(V) se ha determinado por simulación computacional de los espectros EPR, estimándose que los complejos de cromo(V) más ¿estables¿ son del tipo bis[1,2-diolsecundario] establecidos a partir de ¿pinzas¿ alcoholato en posición gauche. El manitol, respecto a los demás compuestos probados, presenta una conformación óptima de cara a la formación de dichos complejos. La conversión de estos a cromo(III) podría ser favorecida por el intercambio de un ligando diol por un aldehído hidratado, ya que el producto de cromo(III) contiene un ácido carboxílico en su esfera de coordinación, como se ha comprobado por espectroscopia Infrarrojo. En presencia de exceso de los principales agentes reductores celulares, ácido ascórbico y glutatión, la conversión del cromo(VI) a cromo(III) es ¿instantánea¿, según se ha confirmado por espectroscopias EPR y Ultravioleta-Visible, mediante las que no se ha observado la presencia de complejos de cromo(V)-manitol. Así mismo el manitol parece alterar el curso de la reacción ya que los productos solubles de cromo(III) obtenidos en su presencia son diferentes. Durante la exposición de poblaciones celulares al cromo(VI) la presencia de concentraciones milimolares de manitol disminuye sus efectos: a nivel de la citotoxicidad, determinada según la capacidad reductora celular (test del MTT); del aumento de la fase de aclimatación, determinada por recuento celular in situ al Microscopio Óptico; de la incidencia de hipometilación en las islas CpG del ADN genómico, evaluada por un método basado en la restricción sensible a la metilación; y a nivel de la heterogeneidad del patrón de crecimiento y de la morfología celular y membranar, evaluadas respectivamente por microscopía Óptica y de Fuerzas Atómicas (AFM). En experimentos in vitro el manitol protege el ADN de la acción del cromo, según se ha comprobado por AFM y por el método de Movilidad Electroforética en gel de agarosa.
El manitol, una sustancia natural muy abundante en plantas, presenta buenas características farmacológicas y podría ser de gran valía en la profilaxis del cáncer de pulmón inducido por exposición al Cr(VI).
Las conclusiones del trabajo son:
1. La mayor parte del cromo(VI) añadido al sistema permanece en el espacio extracelular al ser rápidamente reducido por la matriz de colágeno/albúmina sérica. Esta interacción contribuye a la toxicidad del cromo(VI).
2. Dependiendo de la dosis, el cromo(VI) puede inducir efectos beneficiosos o citotóxicos, presentando un LD50 micromolar (alrededor de 4 ¿M).
3. Dosis crónicas sub-citotóxicas de cromo(VI) inducen características tumorales sin haber señales de la incidencia de mutaciones o aducción al ADN.
4. El manitol disminuye, en todos los ámbitos estudiados, los efectos tóxicos del cromo(VI) debido a su capacidad para estabilizar el estado de oxidación V del cromo en forma de complejos.
