Resumen de Neurofibromatosi de tipus 1: anàlisi de mutacions que afecten el correcte procesament del pre-mrna del gen nf1. Estudi de la modulació de l'splicing com a estratègia terapèutica
Els resultats obtinguts en la present tesi s¿estructuren en tres apartats, tal i com es presenten els objectius, i es poden resumir de la següent manera.
(1) Anàlisi de les mutacions NF1 en la població espanyola. Estudi de l¿efecte d¿aquestes mutacions en el processament del pre-mRNA del gen NF1 El primer objectiu d¿aquesta tesi va ser l¿estudi de l¿espectre mutacional del gen NF1 (exceptuant les grans delecions del gen i les variacions en el nombre de còpia d¿exons). Es van analitzar totes les mutacions NF1 identificades a la nostra població fins l¿any 2006, determinant la seva distribució, la recurrència i el seu efecte a nivell de mRNA. Es presenta una revisió de totes les mutacions identificades mitjançant l¿anàlisi de la regió codificant del gen NF1 a partir de mRNA amb la tècnica de SSCP/HD, fent major èmfasi en les mutacions recurrents i les mutacions que alteren el correcte splicing del gen NF1.
El primer article és una compilació de totes les mutacions identificades fins l¿any 2006, incloent les del treball anterior, fent una descripció de la seva distribució, de la recurrència i de la natura de les mateixes, i en especial de les mutacions més freqüents a la nostra població, com són les mutacions frameshift i les mutacions que a nivell de mRNA afecten l¿splicing del gen. Com a complementació de l¿article es presenta un estudi pilot d¿anàlisi de 5 mutacions recurrents en pacients NF1 prèviament no estudiats, per tal d¿avaluar la possibilitat de dur a terme un screening de mutacions recurrents al gen NF1, com a primer pas de la rutina de l¿anàlisi mutacional del gen NF1.
(2) Estudi de la variabilitat d¿expressió de mutacions de splicing Tenint en compte que per a altres malalties, com la fibrosi quística, la variabilitat fenotípica entre pacients portadors de la mateixa mutació de splicing s¿havia associat a variacions individuals en la regulació del mecanisme de splicing, es va pensar que aquest mecanisme també es podria trobar implicat en la severitat clínica de la NF1 per a pacients portadors de d¿aquest tipus de mutacions. Així doncs, en el segon article i segon objectiu d¿aquesta tesi es presenta un estudi semiquantitatiu d¿expressió de diferents mutacions que afecten el correcte splicing de 3 exons del gen NF1, per tal d¿avaluar l¿existència de diferències en els nivells de transcrits aberrants entre els pacients portadors de la mateixa mutació.
(3) Modulació de l¿splicing del gen NF1. Aproximacions terapèutiques per a la neurofibromatosi de tipus 1 Aproximadament un 30-40% dels pacients amb NF1 presenten mutacions de splicing. Per aquest motiu el tercer objectiu d¿aquesta tesi ha estat l¿estudi de dues possibles aproximacions terapèutiques diferents per corregir l¿splicing aberrant produït per mutacions de splicing en pacients NF1 i avaluar el seu possible ús com a agents terapèutics.
En el tercer article es presenta un estudi de la modulació de l¿splicing al gen NF1 mitjançant una aproximació general, com és l¿ús de fàrmacs o compostos químics, prèviament descrits com a moduladors de l¿splicing per a altres malalties, tals com la kinetina, l¿àcid valproic, el butirat sòdic, l¿aclarubicina i el (-)- epigallocatechin gallate.
En el quart article es presenta un estudi de la modulació de l¿splicing més específic, dirigit a un tipus de mutacions de splicing localitzades dins l¿intró i que introdueixen un exó críptic dins l¿mRNA. La tècnica emprada va ser l¿ús d¿oligòmers antisentit del tipus morfolino (AMO, per Antisense Morpholino Oligomer), per a restablir l¿splicing normal de tres mutacions intròniques internes (c.288+2025T>G, c.5749+332A>G, c.7908-321C>G).
¿ L¿estudi de l¿espectre mutacional del gen NF1 a la nostra cohort de pacients ha evidenciat que les mutacions puntuals es distribueixen al llarg de tot el gen NF1 i que la majoria són úniques, tot i que una tercera part dels pacients presenta mutacions recurrents. La metodologia emprada demostra un biaix en la detecció de mutacions cap a una detecció preferencial de les mutacions de splicing i frameshift en detriment de les nonsense i missense.
¿ A la nostra cohort, un 40% dels pacients amb mutacions presenten mutacions de splicing. Un 81,5% d¿aquestes mutacions es troben als llocs consens de splicing, un 13,7% a seqüències codificadores i un 4,8% a zones internes dels introns. En general, la predicció in silico de l¿efecte a mRNA de les mutacions de splicing fou bona, tot i que en alguns casos, no va concordar amb les dades experimentals. Aquestes discrepàncies confirmen la importància de que els estudis mutacionals, també es realitzin a nivell de RNA sempre que sigui possible.
¿ Mutacions de splicing que afecten el correcte processament dels exons 7, 29 i 37 del gen NF1, generen un perfil de transcrits NF1 associat a cada mutació.
L¿anàlisi d¿aquest perfil transcripcional en diferents pacients portadors d¿aquestes mutacions ha permès concloure que cada perfil està fortament definit per la mutació NF1, i està influenciat de manera molt més lleu per les diferències entre individus portadors, o entre els diferents teixits analitzats.
¿ S¿ha identificat un fàrmac, la kinetina, que ha revertit l¿splicing aberrant produït per quatre mutacions NF1 de splicing. Donat que aquestes mutacions es localitzen a zones codificadores, la kinetina no podria ser emprada amb finalitat terapèutica en aquests pacients. Tot i així, la confirmació del seu efecte sobre l¿splicing confirma la seva utilitat com a agent modulador d¿aquest mecanisme.
¿ L¿ús dels morfolinos com a agents correctors de l¿splicing aberrant en mutacions NF1 deep intronic, ha mostrat gran efectivitat tant a nivell de mRNA com de correcció de la funció de la neurofibromina: ¿ S¿ha restaurat l¿splicing normal per les 3 mutacions estudiades (c.288+2025T>G, c.5749+332A>G, c.7908-321C>G) en dos tipus cel·lulars diferents (fibroblasts i limfòcits) derivats de pacients NF1 portadors.
¿ S¿ha observat una reducció dels nivells de Ras actiu després del tractament amb morfolino, consistent amb una correcció de la funció de la neurofibromina.
