Análisis genético y molecular de las enfermedades de niemann-pick a/b y c. Modelo celular y estrategias terapéuticas
- Autores: Laura Rodríguez Pascau
- Directores de la Tesis: Lluïsa Vilageliu Arqués (codir. tes.), Daniel Grinberg Vaisman (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2011
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Susana Balcells Comas (presid.), Anna Diaz Font (secret.), Andrea Dardis (voc.)
- Materias:
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- Resumen
La tesis doctoral se basa en el estudio genético y molecular y el desarrollo de posibles estrategias terapéuticas para dos enfermedades lisosómicas: la enfermedad de Niemann-Pick A/B y la enfermedad de Niemann-Pick C. La enfermedad de NPA/B está causada por mutaciones en el gen SMPD1, localizado en el cromosoma 11, que codifica la enzima lisosómica soluble esfingomielinasa ácida. En cambio, la enfermedad de NPC es debida, mayoritariamente, a mutaciones en el gen NPC1, localizado en el cromosoma 18, que codifica una proteína integral de la membrana lisosómica. El funcionamiento erróneo de estas proteínas da lugar a una acumulación de lípidos, distinta en cada caso, en el interior de los lisosomas, motivo por el cual estas enfermedades se incluyen dentro del grupo de enfermedades de acumulación lisosómica.
En relación con la enfermedad de Niemann-Pick A/B, en un análisis mutacional de 21 pacientes españoles se identificaron 17 mutaciones diferentes, 10 de las cuales no habían sido descritas previamente. Para seis de las mutaciones de cambio de sentido nuevas identificadas se ha realizado un estudio de expresión y caracterización bioquímica de las proteínas mutadas confirmándose su patogenicidad. Se han establecido correlaciones genotipo-fenotipo para la mayoría de las mutaciones y se ha caracterizado a nivel de RNA una mutación que afecta al proceso de splicing, dando lugar a tránscritos de SMPD1 previamente descritos que no codifican proteína funcional.
Respecto a la enfermedad de Niemann-Pick C, se ha llevado a cabo un análisis molecular en pacientes de origen predominantemente español. Entre las nuevas mutaciones identificadas encontramos las dos primeras deleciones descritas que incluyen el gen NPC1 y genes flanqueantes. Estas dos grandes deleciones han sido confirmadas y acotadas mediante el análisis de la segregación de diferentes polimorfismos en las familias y mediante la técnica de QMPSF. Por otra parte, se ha identificado y caracterizado una mutación intrónica profunda nueva que crea un donador de splicing críptico y altera el patrón de splicing dando lugar a la generación de un pseudoexón. Este tipo de mutaciones son susceptibles a ser corregidas mediante el uso de oligonucleótidos antisentido. Con este objetivo, se diseño un oligonucleótido antisentido de tipo morfolino dirigido al lugar críptico de splicing generado por la mutación y se transfecto en fibroblastos en cultivo del paciente. Utilizando esta aproximación, se consiguió restaurar el splicing normal.
La enfermedad de Niemann-Pick C es una patología muy compleja para la que, actualmente, las opciones terapéuticas son muy limitadas. Un inconveniente a la hora de desarrollar nuevas aproximaciones terapéuticas es la ausencia de modelos celulares neuronales de la enfermedad. En esta tesis, se ha generado un modelo celular neuronal humano estable en células SH-SY5Y mediante el uso de shRNAs. La línea celular generada presenta una acumulación significativa de colesterol libre y un aumento de gangliósido GM2, rasgos característicos de la enfermedad de NPC y puede ser útil para ensayos preliminares de algunos compuestos con finalidades terapéuticas.
