Resumen de Prospection and evaluation of novel bacterial lipases for fine chemistry (prospección y avaluación de nuevas lipasas bacterianes pera la química fina)
Los principales objetivos del presente trabajo son la identificación y aislamiento de nuevas enzimas lipolíticas de la cepa Rhodococcus CR-53 y la evaluación de éstos y otros enzimas para la producción de compuestos de valor añadido.
A pesar del creciente interés por el género Rhodococcus, existe muy poca información en cuanto las lipasas de éste género. Éste hecho juntamente con la disponibilidad en nuestro grupo de investigación de la aislado ambiental con actividad lipolítica Rhodococcus CR-53 (Falcocchio et al. 2005) motivó la búsqueda de nuevas lipasas de éste género a partir de Rhodococcus CR-53.
Mediante la utilización de cebadores consenso y ¿gene walking¿ Se identificó y se aisló el gen lipR que codifica por una posible lipasa. Se clonó el gen lipR obteniendo el clon recombinante OrigamiTM/ pGastonLipR el qual mostró actividad lipolítica confirmando que del gen lipR codifica por un enzima lipolítica que fuen denominada LipR. La producción por parte del clon OrigamiTM/ pGastonLipR de la proteína LipR en forma soluble permitió la purificación y posterior caracterización bioquímica de LipR. La caracterización bioquímica reveló que LipR es una enzima que presenta un comportamiento intermedio entre las lipasas auténticas y las esterasas. Debido a su elevada similitud con otras posibles lipasas se consideró que LipR es una lipasa auténtica. El análisis de secuencia y alineamientos de la secuencia aminoacídica de LipR reveló que es el primer miembro de una nueva familia de lipasas bacterianas que comparten un conjunto de motivos consenso que claramente distinguen éste grupo de otros previamente descritos. De acuerdo las familias previamente descritas LipR sería el primer miembro de la nueva familia X. Estudios estructurales con LipR revelaron la presencia de un ¿oxyanion hole¿ de tipo Y. Es la primera vez que se describe una lipasa bacteriana con un ¿oxyanion hole¿ de tipo Y. Por otra parte la utilización de cebadores consenso y ¿gene walking¿ permitió identificar un gen estR que codifica por una posible haloperoxidas no-hemo. Sin embargo la expresión del gen generó una elevada formación de cuerpos de inclusión que no permitieron caracterizar la proteína.
Finalmente, diseñando cebadores específicos a partir del genoma publicado de la cepa R.erythropolis PR4 se pudieron identificar clonar en E.coli dos genes (est3y est4) que codifican por posibles esterasas, obteniendo los correspondientes clones recombinantes E. coliBL21/pET101Est3 y E. coliBL21/pET101Est4. Los dos clones mostraron actividad lipolítica confirmando que los genes clonados est3 y est4 codifican por enzimas lipolíticas que fueron denominados Est3 y Est4. Sin embargo, tan sólo la enzima Est4 pudo obtenerse de forma soluble permitiendo su purificación y caracterización bioquímica. Se observó que Est4 presenta un comportamiento típico de las esterasas y el análisis de su secuencia aminoacídica permitió clasificar ésta enzima cómo un nuevo miembro de la familia IV de lipasas bacterianas.
La utilización de lipasas para la síntesis de aromas es una prometedora estrategia que permite obtener estos compuestos evitando procesos contaminantes, además de aprovechar la enantioselectividad de éstas enzimas para generar compuestos aromáticos enantioméricamente puros. En este sentido se evaluó la capacidad de la enzima LipR para realizar la transesterifiación entre el p-NP decanoato y el etanol generando etil decanoato, para determinar si ésta enzima podría ser utilizada en procesos de síntesis de aromas en medio orgánico. Sin embargo bajo los candiciones ensayadas no se produjo la reacción.
La resolución cinética de alcoholes terciarios mediante esterasas es una prometedora estrategia para obtener éstos valiosos compuestos de manera ópticamente pura y evitado procesos contaminantes. Sin embargo se ha observado que sólo las esterasas que presentan el motivo GGG(A)X en oxyanion hole pueden hidrolizar ésteres de alcoholes terciarios.
Se evaluó la capacidad de la esterasa EstA de Paenibacillus barcinonensis para la resolución cinética de alcoholes terciarios observando que la enzima EstA presenta muy baja actividad hidrolítica contra ésteres de alcoholes terciarios. Un alineamiento basado en la estructura permitió identificar el ¿oxynion hole¿ de EstA con un motivo GGSX muy poco frecuente y al que se atribuyó la baja actividad de EstA. A partir de mutagénesis dirigida se cambió la sequencia del ¿oxyanion hole¿ restaurando el motivo canónico GGG(A)X. Éste cambio se tradujo en un incremento drástico de la actividad hidrolítica de EstA contra ésteres de alcoholes terciarios. Además, la introducción del motivo AGAX en el ¿oxyanion hole¿ de EstA permitió generar una variante con elevada enantioselectividad. Similares resultados habían sido previamente observados en la esterasa BS2 de Bacillus subtilis confirmando de esta manera la importancia del motivo AGAX sobre la enantioselectividad en la resolución cinética de alcoholes terciarios.
