Diseño, síntesis y estudio de la actividad biológica y biofísica de antibióticos lipopeptídicos cíclicos
- Autores: Montserrat Rodríguez Núñez
- Directores de la Tesis: Francesc Rabanal Anglada (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2011
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Isabel Haro Villar (presid.), Ernesto Nicolás Galindo (secret.), María Antonia Busquets Viñas (voc.)
- Materias:
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- Resumen
En este trabajo se han diseñado y sintetizado análogos cíclicos por enlace disulfuro entre dos residuos de cisteína del antibiótico lipopeptídico cíclico policatiónico polimixina B, que es muy efectivo y selectivo contra bacterias Gram-negativas.
Se ha encontrado que los análogos sintéticos sP-3Arg[1,3,8] y sP-5Arg[1,3,5,8,9] presentan un amplio espectro de acción antimicrobiano, ya que muestran actividad frente a alguna de las bacterias Gram-positivas ensayadas manteniendo la actividad en el orden de magnitud µM frente a las bacterias Gram-negativas. Además, el hecho de que muestren una baja citotoxicidad in vitro los convierte en candidatos prometedores para el desarrollo como fármacos peptídicos En el Capítulo 1 se describe el desarrollo de nuevos métodos acidolíticos para la preparación de dichos péptidos, y de péptidos en general, por el método de la fase sólida sin la necesidad de utilizar espaciadores bifuncionales lábiles al ácido trifluoroacético (TFA) ni bases de Lewis o nucleófilos blandos en el reactivo acidolítico, y es especialmente útil para la desprotección y desanclaje de péptidos sintetizados por estrategia Fmoc/tBu y Boc/Bzl anclados directamente sobre las resinas de poliestireno 4-metilbenzhidrilamina (MBHA) y hidroximetilo (HMPS). En el caso de la estrategia de síntesis Boc/Bzl, los grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos trifuncionales han de ser de tipo bencílico.
Las mezclas acidolíticas óptimas que se han hallado están compuestas por: 1. TFA, clorotrimetilsilano (TMSCl), un trialquilsilano como el trietilsilano (TES) o el triisopropilsilano (TIS), y disolución comercial de HBr en ácido acético.
2. TFA, TMSCl y TES o TIS.
3. TFA, Br2 y TES, cuya reacción genera in situ HBr y bromotrietilsilano (TESBr).
4. TFA y TES.
Estos reactivos acidolíticos permiten obtener los péptidos con elevada puresa y rendimiento.
En el Capítulo 2 se describe el diseño, la síntesis y el estudio de la actividad biológica y biofísica de análogos de la polimixina B.
El diseño de dichos análogos se basa en las siguientes modificaciones sobre la estructura de la PxB: ¿ La substitución del enlace lactámico por un enlace disulfuro. Para ello se sustituyeron los residuos Dab-4 y Thr-10 por dos Cys. En concreto la Cys-10 está amidada.
¿ La sustitución de la cadena de ácido graso (S)-6-metiloctanoil por nonanoil, que es comercial.
¿ La sustitución de parte o de todos los residuos de ácido diaminobutírico (Dab) por residuos de Arg.
Para realizar la síntesis de los análogos de polimixina B se aplicaron los métodos acidolíticos desarrollados en el Capítulo 1, por ejemplo, todos los análogos se sintetizaron sobre la resina MBHA sin incorporar un espaciador bifuncional lábil al TFA.
Se evaluó la actividad antibiótica de los análogos sintetizados tanto en bacterias Gram-negativas como en Gram-positivas. Como ya se ha citado anteriormente, se encontró que los análogos sP-3Arg[1,3,8] y sP-5Arg[1,3,5,8,9] mostraban un amplio espectro de acción antimicrobiano, mientras que el resto de análogos mostraron una débil actividad frente a las bacterias Gram-positivas, y respecto a las bacterias Gram-negativas resultaron ser menos activos que la PxB, pero con valores de concentración mínima inhibitoria (CMI) comparables a la propia PxB ya que eren del mismo orden de magnitud.
También se evaluó la citotoxicidad de los compuestos con mejor acción antibiótica, sP-2Arg[1,8], sP-3Arg[1,3,8] y sP-5Arg[1,3,5,8,9], en tres modelos celulares diferentes, células de la piel humana, células renales y células del sistema nervioso central. Los resultados obtenidos indicaron que los análogos ensayados presentaban una baja citotoxicidad, con valores de IC50 del orden de 102 µM. Comparando estos resultados con los de actividad antimicrobiana se observó una relación de selectividad aproximada de 1:100, es decir, los compuestos son 100 veces más activos frente a las bacterias respecto a las células eucariotas.
Se realizó un estudio biofísico de los análogos de polimixina B utilizando vesículas lipídicas unilamelares y monocapas extendidas en la interfase aire/agua, como modelos de las membranas bacterianas. En general, se pudo concluir que todos los análogos de PxB seguían el mismo mecanismo de acción que la PxB, ya que también inducían la formación de contactos vesícula-vesícula y el intercambio lipídico entre vesículas, como también presentaban un buen nivel de inserción en las monocapas de lipopolisacárido (LPS) de las bacterias Gram-negativas.
Debido a estos buenos resultados, también se pensó en diseñar y sintetizar análogos de otro antibiótico lipopeptídico cíclico, la daptomicina, que es aniónico y selectivo contra bacterias Gram-positivas.
Se diseñaron y se sintetizaron en fase sólida dos análogos de la daptomicina con los mismos principios de diseño que se aplicaron en los análogos de PxB, por ejemplo la ciclación también se llevo a cabo a través de un puente disulfuro. Sin embargo, dichos compuestos resultaron ser inactivos.
