Resumen de Structural and functional studies on hmra¿a zn-dependent hydrolase involved in methicillin resistance
Methicillin resistance in Staphylococcus aureus (MRSA) involves the interplay of a large series of chromosomally-encoded factors, among them protein HmrA. We analyzed structure and function of this protein and found it cleaves peptide and protein substrates but not ß-lactam antibiotics. It efficiently processed peptidoglycan but was not a muramidase. Structural studies showed that HmrA is a dimetalated zinc endopeptidases consisting of a three-layer (¿ß¿)-sandwich catalytic domain and an inserted open-faced ß¿ß sandwich oligomerization domain. Elastic network model calculations and comparison with structurally-related amidohydrolases suggested that HmrA undergoes an interdomain hinge rotation during the transition from an open unbound to a closed bound conformation for catalysis. The active-site cleft is located at the domain interface and extended, i.e. able to accommodate peptides. It features a double-zinc site with a unique ligand combination centred on a metal-bridging cysteine. Anomalously for such amidohydrolases, four HmrA protomers assemble to a large ~170-kDa homotetrameric complex of 125Å. All four active sites are fully accessible and ~50-70Å apart, i.e. far enough apart to act on a large meshwork substrate independently, but simultaneosuly. In vivo studies with four S. aureus strains of variable resistance levels against oxacillin revealed that when overexpressed intracellularly in trans, HmrA caused subtle alterations in the phenotypic expression of -lactam resistance, which were temperature- and strain-dependent. Remarkably, purified HmrA added extracellularly conferred protection against oxacillin to S. aureus strains in growing assays. All these results indicate that HmrA is a zinc-dependent peptidase that may contribute to cell-wall biosynthesis and turnover in vivo by minimizing the autolytic effects induced by -lactams. The structure and function of HmrA has implications for MRSA but also for most S. aureus strains whose genomic sequences are known, and for several other cocci and bacilli, which harbor close orthologs. This strongly suggests that HmrA is a new widespread antibiotic resistance factor in bacteria.
La resistencia a meticilina en Staphylococcus aureus (MRSA) implica la interacción de una serie de factores codificados en el cromosoma, entre ellos la proteína HmrA. Se analizó la estructura y la función de esta proteína y se verificó que hidroliza sustratos como péptidos y proteínas, pero no antibióticos -lactámicos. Además aunque procesa de manera eficiente péptidoglicano, no es una muramidasa. Los estudios estructurales han demostrado que HmrA es una endopeptidasa dependiente de zinc y formada por un dominio catalítico de tres capas del tipo -sándwich y un dominio de oligomerización del tipo sándwich insertado en el catalítico. Cálculos del modelo con redes elásticas y la comparación del mismo con amidohidrolases estructuralmente relacionadas con HmrA sugirieran que se produce una rotación tipo bisagra entre dominios durante la transición de una conformación abierta-libre a una conformación cerrada y unida al sustrato, indispensable para a la catálisis. La hendidura del centro activo se encuentra en la interfaz entre los dominios y es alargada, es decir, capaz de acomodar péptidos de varios residuos. Cuenta con un doble sitio de zinc con una combinación única de ligandos centrados en una cisteína, que une los dos metales de transición. HmrA posee una estructura cuaternaria poco común para amidohidrolasas, en la que cuatro protómeros se unen para formar un gran complejo homotetramérico de ~ 170kDa y 125Å de dimensión máxima. Los cuatro sitios activos son totalmente accesibles y están separados por ~50-70Å, es decir, lo suficiente para actuar en una gran malla de sustrato de forma independiente pero simultanea. Estudios in vivo con cuatro cepas de S. aureus de diferentes niveles de resistencia frente a oxacilina revelaron que, cuando el gen hmrA se sobreexpresa intracelularmente en trans, causa alteraciones sutiles en la expresión fenotípica de la resistencia frente a -lactámicos, que es dependiente de la temperatura y la cepa. Sorprendentemente, cuando se añadió extracelularmente HmrA purificado en ensayos de crecimiento, esta proteína confiere protección contra la oxacilina a las cepas de S. aureus testadas. Todos estos resultados indican que HmrA es una peptidasa dependiente de zinc, que puede contribuir, in vivo, a la biosíntesis y remodelación de la pared celular, minimizando los efectos autolíticos inducidos por antibióticos ß-lactámicos. La estructura y la función de HmrA no sólo tiene implicaciones para cepas MRSA, sino también para la mayoría de cepas de S. aureus, cuyas secuencias genómicas son conocidas, y para varios otros cocos y bacilos, que albergan ortólogos cercanos. Esto sugiere que HmrA es un nuevo factor de resistencia frente a antibióticos ampliamente distribuido entre bacterias.
