Resumen de Structural studies of proteins and protein complexes by mass spectrometry and atomic force microscopy
Esta tesis se basa en el desarrollo I la utilización de aproximaciones basadas en la espectrometría de masas para identificar i caracterizar proteínas o complejos no covalentes de proteínas.
En primer término se ha utilizado la espectrometría de masas como una aproximación alternativa i complementaria a las aproximaciones clásicas de la biología estructural, como son las cristalografía, la resonancia magnética nuclear,... La interacciones débiles no covalentes, intra o intermoleculares, juegan un papel dentro de la estructura i el funcionamiento del sistema biológico. Es por este motivo que es esencial obtener información sobre la identidad de los péptidos implicados en estas interacciones. La estructura tridimensional de la subunidad proteica P62 del factor de transcripción TFIIH no se conoce. Es por este motivo que hemos desarrollado un método de identificación de los péptidos que están enlazados de manera no covalente a la subunidad del factor de transcripción FTIIH mediante la técnica de espectrometría de masas. Esta subunidad del factor de transcripción FTIIH mediante la técnica de espectrometría de masas. Esta subunidad se puso en presencia de enzimas de digestión en concentraciones crecientes.
El análisis por espectrometría de masas de los péptidos resistentes a la digestión y previamente separados mediante un gel de electroforesis unidimensional, nos permitió identificar los residuos organizados en dominios compactos de la secuencia primaria de la proteína, ofreciendo así una apreciación de su organización modular.
La espectrometría de masas también nos permitió, mediante la cromatografía de líquidos y la espectrometría de masas en tándem, encontrar evidencias de la mutación de un aminoácido en un complejo multiproteico no covalente. Esta mutación puntual de la cadena beta de la hemoglobina humana, presenta la particularidad de no modificar las propiedades físico-químicas de la hemoglobina, esto hace que no sea detectable con otras técnicas electroforéticas clásicas.
En segundo lugar, nos interesamos por el estudio de estructuras de proteínas y de complejos proteicos no covalentes sobre una superficie. La microscopia de fuerzas atómicas ha sido elegida como la técnica más apropiada para este tipo de estudio. Así, estudiamos y visualizamos por microscopía de fuerzas atómicas, la formación de fibrillas para el auto ensamblaje de un tetrapéptido.
Este primer resultado nos llevó a desarrollar herramientas de análisis para las interacciones proteicas no covalentes, compatibles con las técnicas de nanotecnología y espectrometría de masas. Así pues, funcionalizamos una superficie con el péptido beta amiloide, con la finalidad de caracterizar su interacción con proteínas. Esta superficie de oro se funcionaliza mediante una cadena alquílica con un extremo tiol para asegurar la interacción con la superficie y con el otro extremo un pentaetilenglicol, para evitar una absorción inespecífica de proteínas sobre la superficie. Estas cadenas modificadas contenían una amina libre que permití ala introducción de un grupo maleimido, el cual permitió la unión con el péptido beta-amiloide.
El péptido beta-amiloide es un péptido implicado en la enfermedad de Alzheimer. Su acumulación y degradación conducen a la formación de placas seniles, una de las lesiones observadas en la enfermedad. La tendencia natural de agregación de este péptido hace que sea muy difícil trabajar en soluciones acuosas. Recientes trabajos de síntesis en fase sólida han permitido la síntesis y purificación del péptido beta amiloide. La estrategia de síntesis se basa en la utilización de un aminoácido O-acil en la secuencia del péptido en cuestión para aumentar considerablemente su solubilidad. Una vez obtenido, este O-acil isopéptido se puede convertir fácilmente en un péptido N-acil (que es el péptido original) mediante una reacción de reorganización intramolecular a pH básico. Utilizando este método obtuvimos sin dificultad el isopéptido soluble O-acil beta amiloide. La originalidad de este trabajo se basa en la utilización del isopéptido soluble O-acil beta-amiloide, para inmovilizarlo principalmente en forma monoméricas sobre nuestra superficie y permitir su reconversión en el péptido original vía reorganización molecular directamente sobre la superficie. Esta superficie se caracterizó mediante espectrometría de masas y microscopía de fuerzas atómicas para asegurar la presencia del péptido beta-amiloide sobre la superficie.
Demostramos que nuestra superficie funcionarizada con el péptido beta amiloide era funcional y permitía las interacciones no covalentes péptido-proteína utilizando un anticuerpo anti-péptido amiloide. Esta interacción antigeno-anticuerpo se observó mediante microscopía de fuerzas atómicas.
El objetivo a largo plazo es utilizar esta técnica para identificar nuevas interacciones entre el péptido beta amiloide y proteínas extraídas de cerebros de pacientes con Alzheimer en diferentes estados de la evolución de la enfermedad.
Nuestro modelo de interacción sobre superficies se validó con otras proteínas que interaccionan con el péptido beta amiloide y demostramos su compatibilidad con los métodos de proteómica actual. Así pues, realizamos digestiones enzimáticas directamente sobre la superficie permitiendo así la identificación de proteínas mediante espectrometría de masas y espectrometría de masas en tándem.
En conclusión, la espectrometría de masas se ha establecido como herramienta potente para la identificación y caracterización de proteínas y complejos proteicos no covalentes. Su sinergia con la microscopia de fuerzas atómicas nos ha permitido el desarrollo de una superficie apropiada para el estudio de interacciones proteicas no covalentes.
