Diferencias en la localización subcelular y los mecanismos moduladores de la actividad de los adrenoceptores alfa1 y beta
- Autores: Vanessa Segura
- Directores de la Tesis: María Pilar D'Ocon Navaza (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2010
- Idioma: español
- Materias:
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- Resumen
Introducción Los adrenoceptores (ARs) se dividen en dos grandes grupos ,alfa y beta, y además se expresan en el músculo liso vascular donde juegan un papel fundamental en la regulación de la presión arterial. Generalmente, los ARs alfa median la contracción y los ARs beta la relajación de los vasos sanguíneos. Sin embargo, la funcionalidad de cada subtipo no se ha definido claramente asi como la razón de la coexistencia de varios subtipos en un mismo tejido o la diferente distribución de los subtipos en los vasos sanguíneos. El objetivo del presente trabajo es analizar estos aspectos para los tres subtipos de ARs ¿1.
Material y métodos.
Hemos estudiado la internalización de los ARs ¿1 mediante microscopía confocal. Para ello, hemos insertado una etiqueta (VSV-G) detectable con alta afinidad por anticuerpos en el extremo amino terminal de cada subtipo. A continuación, hemos transfectado cada subtipo en células HEK293. Para validar este modelo celular, hemos cuantificado la expresión de estos receptores mediante RT-PCR, Western blot y unión de radioligandos. Además, hemos analizado dos señales intracelulares acopladas a estos receptores: la activación de ERK1/2 mediante western blot y la mobilización de Ca+2 intracelular, utilizando un quelante de calcio fluorescente (FLUO3) y microscopía confocal. Posteriormente, analizamos el comportamiento de los ARs ,¿1 y beta nativos, en vasos (arteria aorta y caudal de rata). En primer lugar caraterizamos la expresión de estos receptores mediante RT-PCR, visualizamos la presencia de caveolas la membrana plasmática mediante microscopía electrónica y finalmente analizamos los mecanismos de regulación y la implicación funcional de cada subtipo en ambos vasos mediante la técnica de baños de órganos.
Resultados.
Las células HEK293 transfectadas con cada construcción de los tres subtipos de ARs VSV-G ¿1, expresan proteínas funcionales que retienen su capacidad para activar cascadas de señalización intracelular como ERK1/2 y mobilización de Ca+2. Los subtipos VSV-G-¿1A y VSV-G-¿1B manifiestan diferentes patrones de internalización pero ambos se internalizan constitutivamente y en presencia de agonista. El subtipo VSV-G-¿1D no manifestó internalización detectable en endosomas acídicos.
Las arterias aorta y caudal expresan ARNm para cada uno de AR los tres subtipos de ARs ¿1y beta aunque existen diferencias en la abundancia relativa de cada AR en cada tejido. En aorta de rata dónde el subtipo ¿1D es el principal implicado en la respuesta funcional, la cinética de contracción tras estimulación adrenérgica y la cinética de relajación tras desparición del estímulo contráctil son lentas. Además la contracción inducida por este subtipo es depediente del proceso de endocitosis mediada por clatrina e independiente de la integridad de las caveolas. Aunque los dos subtipos beta1 y beta2 producen una vasodilatación mediante mecanismos dependientes e independientes de NO, en presencia de endotelio, el subtipo beta2 participa en la relajación de la aorta mediante la via NO/GMPc. En contraste, cuando no hay endotelio el subtipo beta1 media la relajación en aorta de rata mediante mecanismos independientes de NO. Hay que destacar, que la relajación de ambos subtipos depende de la integridad de los microdominios de membrana denominados caveolas.
En arteria caudal de rata dónde el subtipo alfa1A es el principal implicado en la respuesta funcional, la cinética de contracción tras estimulación adrenérgica y la cinética de relajación tras desparición del estímulo contráctil son muy rápidas en comparación con las de la aorta. La inhibición de la endocitosis dependiente de clatrina no afecta a la contracción tras estimulación por agonista, pero en cambio, la desestructuración de las caveolas inhibe la magnitud de la respuesta contráctil. En caudal desprovista de endotelio, el subtipo beta1 es el principal implicado en mediar la vasodilatación y la actividad del subtipo beta2 se manifiesta más claramente cuando se desestructura las caveolas del plasmalema, sugiriendo que las caveolas juegan un papel regulador negativo de las cascadas de señalización de los ARs beta en arteria caudal de rata. La inhibición de la endocitosis mediada por vesículas de clatrina no altera la relajación.
En aorta de rata, el endotelio juega un papel regulador al liberar NO durante la respuesta vasocontrictora en respuesta a agonistas alfa1, contrarrestando la acción vasoconstrictora de los AR ¿1 musculares. Esta liberación de NO se potencia tras sucesivas exposiciones a agonistas ¿1 produciéndose un proceso de sensibilización en la liberación dependiente del propio NO, lo que atenua la contracción adrenérgica sostenida.
