Resumen de The growth arrest-specific gene 1 in hepatic cell proliferation: functional role and epigenetic transcriptional regulation
I. INTRODUCCIÓN 1. Estructura y Función de la Cromatina.
En todos los eucariotas el DNA se compacta en el núcleo en la compleja estructura denominada cromatina. La visión tradicional es que la cromatina se requiere para empaquetar la fibra de aproximadamente 2 m de DNA del genoma humano en un núcleo de 10¿m de diámetro medio. Sin embargo, la información más actual indica que la estructura de la cromatina representa un nivel adicional de regulación dinámica para todos los procesos metabólicos del DNA, tales como la expresión génica o la replicación y la reparación del DNA.
La subunidad estructural de la cromatina es el nucleosoma, que consiste en la partícula núcleo compuesta de 147 pb de DNA arrollados alrededor de un octámero de proteínas básicas denominadas histonas: dos dímeros H2A-H2B y un tetrámero H3-H4, más la histona H1 situada fuera de la partícula núcleo. Las histonas que forman parte del interior de la partícula núcleo son una de la proteínas más altamente conservadas a lo largo de la evolución, y poseen un dominio globular en la región C-terminal, crítico para el ensamblaje del nucleosoma, y una cola N-terminal flexible que se proyecta hacia el exterior del mismo.
Las células han desarrollado complejos mecanismos para modificar en una manera espacio-temporal precisa la organización de la cromatina y para asegurar el mantenimiento de dicha organización a través de las divisiones mitóticas y meióticas. Entre estos mecanismos cabe destacar: a. Deslizamiento y/o alteración de la estructura nucleosomal llevada a cabo por factores remodeladores de la cromatina dependientes de ATP, capaces de exponer u ocultar áreas locales del DNA a factores transcripcionales o a la maquinaria de reparación.
b. Modificaciones covalentes post-traduccionales en las histonas, que pueden facilitar o entorpecer la asociación de factores transcripcionales o de otros complejos.
c. Intercambio de histonas canónicas por variantes de histonas, a través de un mecanismo de deposición independiente de la replicación. Las variantes de histonas portan información para conseguir establecer un determinado estado de expresión génica o para responder a condiciones que puedan dañar al DNA.
d. Metilación en la posición C-5 de los residuos de citosina presentes en los dinucleótidos de las islas CpG en los promotores de los genes, por las DNA metiltransferasa (DNMTs), facilitando el silenciamiento génico a largo plazo. Este proceso confiere estabilidad genómica a través de la represión de transposones y elementos repetitivos. El silenciamiento se logra gracias al reconocimiento de las metil-citosinas por proteínas de unión específica al DNA metilado lo que recluta complejos represores de la transcripción y modificadores de histonas.
1.1. Regulación de la estructura y función de la cromatina: Epigenética.
El término epigenética, que significa literalmente por encima de la genética, se utiliza generalmente para describir alteraciones hereditarias de características fenotípicas que no están basadas en cambios en la secuencia primaria del DNA. Por tanto se refiere a la información contenida en la cromatina más allá de su mera secuencia. Los mecanismos antes explicados son responsables de la compleja red epigenética que controla los programas de expresión génica en los eucariotas superiores. Las perturbaciones en los balances epigenéticos conllevarían alteraciones en la expresión génica dando lugar, en última instancia, a la transformación celular y a un crecimiento maligno descontrolado.
Se han descrito diversas modificaciones post-traduccionales en las colas N-terminales y en algunos residuos expuestos de la región globular de las histonas, tales como: fosforilación, acetilación, metilación, ubiquitinación y sumoilación. Estas modificaciones pueden crear o estabilizar sitios de unión para proteínas reguladoras, como los factores transcripcionales, o para proteínas involucradas en la condensación o reparación del DNA. La modificación de histonas también puede tener el efecto opuesto, interrumpiendo u ocultando sitios de unión de dichas proteínas a la cromatina. De acuerdo con esto, existen modificaciones que coexisten y colaboran de una forma cooperativa y/o secuencial pero que son incompatibles con otras en el mismo nucleosoma. De esta forma, a pesar de que la composición básica de los nucleosomas puede ser la misma en un largo tramo de DNA, la combinación específica de modificaciones crea una estructura local y una diversidad funcional que delimitan distintos subdominios cromatínicos.
Se ha postulado que las diferentes modificaciones podrían actuar de una forma secuencial o combinatoria para crear un código de histonas (Strahl y Allis 2000); (Jenuwein 2001) que es leído por proteínas que poseen dominios de interacción específicos para esas modificaciones. Este complejo proceso de modificaciones acarrea dos consecuencias fundamentales: por un lado, debido a que las modificaciones alteran la carga global de las proteínas y las interacciones DNA-histona, se perturba la dinámica nucleosomal dejando a la cromatina más accesible a la unión de las proteínas reguladoras al DNA. Por otro lado, estas modificaciones son esenciales para el reclutamiento de cofactores transcripcionales, al crear marcas distintivas en regiones concretas de la cromatina (Cosgrove et al 2004), y para la propia transmisión de información epigenética (Lopez-Rodas et al 1993).
1.2. Cromatina y transcripción.
Una pregunta que se ha formulado desde hace mucho tiempo es ¿qué les sucede a los nucleosomas durante la transcripción? Durante el proceso de elongación de la transcripción, varios estudios mostraron resultados opuestos respecto al desplazamiento de los nucleosomas en función del experimento. Brown et al. (1984) demostró que existía un desplazamiento de nucleosomas durante la elongación llevada a cabo por la RNA polimerasa II, mientras que Lorch et al (1987) demostró resultados contrarios. Sin embargo, análisis bioquímicos detallados sugirieron que los nucleosomas podían transferirse desde una posición delante de la RNA polimerasa elongante hacia una posición detrás de ésta. Este mecanismo parece funcionar in vitro para polimerasas de bacteriófagos y para RNA polimerasas III eucariotas. Sin embargo, estudios sobre la RNA polimerasa II revelaron que es mucho más difícil para esta enzima pasar a través de un nucleosoma y que, si eso sucede, el resultado es la pérdida de un dímero H2A/H2B (Izban and Luse, 1991).
Parece por tanto que los resultados mencionados anteriormente sugieren la existencia de mecanismos que parcial o completamente desalojan los nucleosomas que se encuentran delante de la RNA polimerasa II elongante, y mecanismos que coordinan el subsiguiente reemplazo de estas histonas.
2. Modelo de proliferación celular: Regeneración hepática.
El correcto funcionamiento de todos los factores y complejos proteicos responsables de establecer y mantener las modificaciones epigenéticas en un tipo celular y en un estado de diferenciación determinados son de crucial importancia para el desarrollo normal de la vida de una célula. Cualquier proceso que desregule el patrón de expresión génica propio de cada tipo celular conllevará, con muchas probabilidades, a una muerte o a una transformación celular en donde el control de la proliferación ya no ocurre de forma adecuada.
La regulación de la proliferación celular es un fenómeno complejo que supone las actividades coordinadas de ciclinas, quinasas de serina/treonina, receptores con actividad de quinasa de tirosina, quinasas de tirosina de la familia src, factores transcripcionales, complejos modificadores y remodeladores de la cromatina y moléculas efectoras tales como el trifosfato de fosfatidil-inositol (PIP3) y el calcio.
Uno de los modelos mejor caracterizado y utilizado para estudiar la proliferación celular in vivo es el de regeneración hepática en roedores. El hígado es el único órgano con la capacidad de regular su masa tanto en humanos como en otros animales. A pesar de su gran carga metabólica, el hígado es un órgano quiescente en términos de proliferación celular, con menos del 0.01% de los hepatocitos dividiéndose en un determinado momento. Este bajo recambio celular puede ser patológicamente alterado por un daño tóxico o por una resección quirúrgica. Estos procesos generan la repentina, masiva y sincronizada proliferación de los hepatocitos remanentes, hecho que permite recuperar la masa hepática funcional a las dos semanas de una pérdida de hasta dos tercios del hígado. La respuesta regenerativa está mediada típicamente por la proliferación de los hepatocitos supervivientes dentro de la arquitectura acinar del hígado. En el caso de la resección, la hipertrofia y la hiperplasia del hígado remanente, resultado de la proliferación celular, cesa una vez alcanzado el tamaño del hígado propio de cada especie, que en ratas y ratones constituye el 4.5% del peso total del animal mientras que en humanos es del 2.5%.
Existen varios modelos animales de regeneración hepática que se basan fundamentalmente en dos procedimientos: la inducción de daño hepático por agentes tóxicos y la resección quirúrgica. El resultado será que las células hepáticas remanentes responderán en ambos casos de forma rápida para paliar el daño producido con mayor o menor eficiencia dependiendo del modelo de proliferación elegido.
En el proceso de regeneración hepática se pueden diferenciarse tres etapas bien definidas: 1) Fase de cebado o primado, 2) Fase de progresión y 3) Fase de finalización de la proliferación (revisado en Fausto et al., 2006).
En función de esta clasificación se han creado categorías para clasificar a los factores solubles y los secretados involucrados en cada etapa de la respuesta regenerativa global (Koniaris et a.,l 2003): 1) Factores para el cebado de los hepatocitos. Estos factores transforman a los hepatocitos en células competentes para responder a los factores de crecimiento. Son, por tanto, los responsables de inducir al hepatocito a abandonar su estado quiescente para entrar en ciclo celular, la denominada transición G0/G1. Este grupo de factores incluye al factor de necrosis tumoral TNFalfa y a la interleukina IL-6.
2) Factores para la progresión de la proliferación. Estos factores permiten que los hepatocitos competentes progresen a través del ciclo (transición G1/S). Este grupo incluye los potentes agentes mitógenos para hepatocitos como el factor de crecimiento hepático HGF, el factor de crecimiento transformante TGF-¿ y el factor de crecimiento epidermal EGF.
3) Comitógenos. Estos factores facilitan la acción de los mitógenos. Ejemplos de este grupo son las hormonas insulina y adrenalina.
4) Inhibidores de la proliferación celular. Estos factores están suprimiendo permanentemente la proliferación del hepatocito pero su expresión disminuye significativamente en el proceso regenerativo. Los principales son la activina A y el factor de crecimiento transformante TGF-ß.
El ratón y la rata son los dos organismos modelo más usados en el estudio de la regeneración hepática debido a su pequeño tamaño, el bajo coste para obtenerlos y mantenerlos y, en el caso del ratón, la posibilidad de manipulación genética. En el modelo de hepatectomía parcial, se eliminan aproximadamente dos tercios de la masa total del hígado quitando los lóbulos izquierdo y mediano (ver Figura 9). Después de la hepatectomía, los hepatocitos abandonan inmediatamente su estado de reposo del ciclo celular (G0) entrando en G1, atraviesan la fase S y finalmente, tras pasar por fase G2, sufren la mitosis. El primer máximo de síntesis de DNA en las células parenquimatosas (hepatocitos y células epiteliales del ducto biliar) ocurre a las 24h en rata y a las 40h en ratón. El otro modelo más utilizado es el de la inducción de daño hepático con gentes químicos. La galactosamina (D-Gal), junto con la endotoxina bacteriana LPS (lipopolisacárido), se utiliza como modelo de shock endotoxémico que produce un daño hepatocelular fulminante. Dado que la D-Gal se metaboliza por las vías de la D-glucosamina sólo en hígado, la eliminación selectiva de nucleótidos de uridina conlleva al bloqueo de la transcripción estrictamente en el hígado. El daño hepático inducido por estas drogas está mediado por TNF-alfa, la cual induce apoptosis al unirse a su receptor de membrana a través de la activación de mediadores como TRADD, TRAIL o caspasas. El TNF-alfa es producido en respuesta a la presencia del LPS por los macrófagos como parte de la respuesta inflamatoria. Sin embargo, el LPS por sí mismo no es capaz de inducir daño hepático a no ser que previamente éste haya sido sensibilizado con la D-Gal.
3. Relevancia del gen Growth Arrest-Specific gene 1 (Gas1) en la regulación de la proliferación celular.
Las células fisiológicamente normales llegan invariablemente a un estado de senescencia y de diferenciación terminal, cesando su proliferación tras un número finito de divisiones celulares, hecho que no ocurre en las células tumorales. Se han identificado en este último tipo de células alteraciones específicas en la expresión génica incluyendo, por ejemplo, la incapacidad de expresar ciertos genes relacionados con el control del ciclo celular.
Cabe destacar la diferencia entre el estado de senescencia celular, -en donde las células abandonan de forma permanente el ciclo celular y son refractarias a estímulos que inducen proliferación-, del estado de quiescencia celular, en el que las células se encuentran en un estado de reposo replicativo (fase G0 del ciclo celular), pero donde aún conservan la capacidad replicativa en respuesta a estímulos mitógenos.
La entrada en estado quiescente no sólo involucra la disminución de la expresión de productos génicos relacionados con la proliferación, sino también el incremento en la expresión de ciertos genes específicos de parada del ciclo celular, conocidos como gas (Growth Arrest-Specific genes), entre otros. Estos productos génicos se expresan específicamente en células quiescentes y disminuyen drásticamente su expresión conforme las células entran en el ciclo celular.
Hasta el momento se han descrito seis genes gas (de Gas1 a gas6) que, aunque codifican proteínas con propiedades bioquímicas diferentes, su función común es la de detener el ciclo celular o inducir apoptosis. La expresión de los genes gas parece ser específica de un estado de reposo en el que las células retienen sus capacidades replicativas. No se asocia con la salida permanente del ciclo celular que suele acompañar a la diferenciación terminal o a la senescencia.
Aunque en general se dispone de muy escasa información de los genes gas, del que cuantitativamente se tienen más datos es del gen Gas1 (revisado en Gartel y Shchors 2003; Schueler-Furman et al., 2006). Este gen, considerado como un supresor de tumores, se clonó inicialmente a partir de fibroblastos quiescentes de ratón NIH3T3 (Schneider et al., 1988). El mRNA de Gas1 se acumula cuando las células entran en quiescencia y disminuye cuando se estimulan con suero o se llega a confluencia celular sin requerir síntesis proteica activa (Cowled et al 1994). La síntesis de DNA se bloquea cuando el gen se expresa ectópicamente en células NIH3T3 normales, o en células transformadas creciendo asincrónicamente, y depende de la presencia de p53 y de pRb funcionales (Del Sal et al. 1992). El gen Gas1 codifica una proteína asociada a la membrana plasmática mediante un anclaje del tipo GPI, el cual es indispensable para ejercer su función inhibitoria (Stebel et al. 2000). GAS1 se acumula por tanto en la superficie celular cuando se induce una parada en la proliferación, disparada bien por privación de suero, o por confluencia en la placa de cultivo.
El factor GAS1 podría llevar a cabo diferentes funciones dependiendo del contexto celular o tisular en que se encuentre y de sus mecanismos de acción y expresión espacio-temporal específicos. Aún no se conocen los mecanismos a través de los cuales GAS1 transmite señales que afectan al destino de la célula: proliferación, parada del ciclo celular o apoptosis. Lo que sí parece evidente es que la proteína GAS1 necesita de la presencia de p53, si bien no es necesaria la función transactivadora de ésta como factor transcripcional (Ruaro et al. 1997). Por tanto, puesto que GAS1 se localiza en la membrana plasmática, la proteína podría estar involucrada en la transducción de alguna señal celular inhibitoria que lleve finalmente a p53.
Se han publicado bastantes datos que sugieren que GAS1 ejerce una función reguladora sobre la señalización activada por RET (Cabrera et al. 2006). Se sabe por ejemplo que GAS1 secuestra a RET en su estado no fosforilado en regiones específicas de la membrana plasmática conocidas como lipid rafts. Estos son dominios de membrana especiales ricos en esfingolípidos y colesterol empaquetados en plataformas que se mueven dentro de la bicapa lipídica de la membrana celular. El secuestro se realiza de una forma independiente de la unión previa del ligando, que media el reclutamiento de SHC y ERK a este dominio de membrana y que bloquea la activación de la quinasa Akt sin afectar la activación de la ruta de ERK.
Por tanto, parece pues importante conocer los mecanismos de control de la proliferación en condiciones fisiológicamente normales, en donde el gen Gas1 podría estar desempeñando un papel fundamental, ya que definidos estos mecanismos puede conocerse qué efectos podría tener su desregulación en procesos patológicos como, por ejemplo, el desarrollo de un tumor. En estos mecanismos se debe prestar especial atención a cómo influye la regulación epigenética en el control de la expresión de genes como Gas1, ya que es en el contexto de la cromatina donde las diversas señales celulares deben integrarse para permitir modular la proliferación celular.
II. OBJETIVOS Objetivo general: ¿ Analizar la regulación del gen Gas1 en un modelo de proliferación celular in vivo y aportar datos para conocer si este gen puede ser una buena diana molecular para inhibir este proceso, por ejemplo, en el desarrollo de tumores hepáticos.
Objetivos específicos: ¿ Poner a punto un modelo adecuado de proliferación celular in vivo de regeneración hepática para el estudio de la regulación transcripcional del gen Gas1.
¿ Estudiar el patrón de expresión génica del gen growth arrest gene-1 (Gas1) en hígado en las diferentes etapas del ciclo celular.
¿ Analizar el mecanismo molecular para la regulación de la expresión de Gas1 a nivel de los cambios en la estructura de la cromatina. En concreto, determinar cómo la unión de factores transcripcionales, de complejos modificadores de las histonas y de remodeladores de la cromatina influyen en el control de su expresión génica.
¿ Analizar el posicionamiento nucleosomal en el promotor proximal del gen Gas1, así como de de modificaciones de histonas, acetilación y metilación, alrededor del inicio de transcripción.
¿ Determinar, a nivel funcional, qué papel desempeña la sobreexpresión de GAS1 en la proliferación celular in vitro, en una línea celular de hepatocarcinoma de ratón, e in vivo, en hígado en proliferación, mediante transfección hidrodinámica.
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. Inducción de proliferación celular en hígado de ratón.
1.1 Regeneración hepática inducida por daño químico.
Con el objetivo de analizar la participación de Gas1 en el control del ciclo celular en hígado, la prioridad consistió en establecer un modelo de proliferación hepática para poder analizar su patrón de expresión en las diferentes fases y los mecanismos reguladores subyacentes in vivo.
El primer modelo que se estudió fue el modelo de regeneración hepática inducida por daño químico en ratón. La administración de un mezcla de las sustancias D-Gal y LPS ocasionan un daño hepático que bloquea la proliferación de los hepatocitos, pero activa la población específica de células ovales (con características de células madre) que son las encargadas de proliferar para restablecer la masa hepática perdida por el daño hepático ocasionado.
Para evaluar el daño hepático generado tras la administración de las sustancias D-Gal y LPS, se midió la actividad ALT en suero. La Figura 21 muestra la actividad ALT tras la administración de 500mg/kg de D-gal/20 ¿g/kg de LPS, y otra mezcla de 600 mg/kg de D-gal/20 ¿g/kg de LPS. Los valores normales de ALT (inferiores a 35 UI/L) son sobrepasados tras 24h para el primer caso, y tras 3h para el segundo, comenzando a disminuir a las 40h en ambos casos.
Tras comprobar que el daño hepático tenía lugar, se determinó la expresión de genes marcadores del ciclo celular para analizar si las células ovales habían abandonado su estado de reposo. La Figura 22 muestra la expresión, por RT-PCR, de los genes pcna (marcador de fase S) y ciclina B1 (marcador de la transicón G2/M). En los tiempos analizados tras la administración de la mezcla tóxica, pcna se observó a las 17 y 24h, mientras que la ciclina B1 se detectó más tardíamente a las 40h y manteniéndose su expresión hasta los 5 días.
Aunque con este modelo fue posible detectar la proliferación de importante población de células, la mortalidad asociada al mismo fue muy elevada (alrededor del 30% de los ratones moría antes de sobrepasar las 24h de administración). Además, la variabilidad en la respuesta frente a los tóxicos fue muy amplia entre los diferentes animales. Otro inconveniente de este modelo residió en la elevada respuesta inflamatoria, que probablemente interferiría con los análisis que se deseaba desarrollar con posterioridad. Debido a estos inconvenientes, y fundamentalmente debido a que el objetivo de obtener una población celular in vivo proliferando sincrónicamente podía realizarse con modelos alternativos que implicaran menos sufrimiento animal, se optó por cambiar el modelo de trabajo.
1.2 Regeneración hepática inducida por hepatectomía parcial.
Debido a las dificultades surgidas durante la optimización del modelo de regeneración hepática inducida por daño químico, se puso a punto un modelo alternativo: la regeneración hepática inducida por hepatectomía parcial (HP). La HP es el modelo mejor caracterizado de proliferación celular in vivo que consiste en la resección quirúrgica del 70% del hígado, para activar la proliferación del 30% restante, que es el encargado de restaurar la masa hepática perdida.
Con la finalidad de determinar si la cirugía se realizaba de forma adecuada y ocurría la inducción de la proliferación de los hepatocitos, se realizó una tinción inmunohistoquímica contra el marcador BrdU, identificándose con un anticuerpo específico contra este análogo la población de células que se encuentran en fase S.
La Figura 24 muestra los resultados de una tinción representativa, donde las células positivas para BrdU, aproximadamente el 50% del total, presentan núcleos teñidos de un color marrón oscuro en la muestra post-HP mientras que en células de hígados control dicha tinción no se observa.
De forma paralela se realizó una tinción hematoxilina/eosina de los mismos hígados para comprobar que la estructura celular no se veía afectada por la cirugía. La Figura 25 muestra imágenes de hígados control y sometido a HP, donde la única diferencia entre ambos reside en la infiltración de células sanguíneas en el parénquima hepático del segundo. Éste no es un fenómeno extraño puesto que, al extraer los dos lóbulos hepáticos mayores, la presión sanguínea incrementa de forma considerable en los lóbulos menores remanentes, provocando dicha infiltración. Por otro lado, cabe destacar la ausencia de zonas necróticas en el hígado hepatectomizado, lo que es indicativo de unas correctas ligadura y resección, y el consecuente adecuado riego sanguíneo en los lóbulos restantes.
Para confirmar la inducción de la proliferación hepática y la ventana temporal en la que este fenómeno ocurría, se analizó la expresión de los genes ciclina E2 y ciclina B1 que marcan las transiciones G1/S y G2/M del ciclo celular, respectivamente. La Figura 26 muestra que la ciclina E2 comienza a expresarse a las 20 h tras HP, se mantiene hasta las 46 h y luego prácticamente desaparece a las 48 h. Por su parte, la expresión de la ciclina B1 comienza de forma más tardía, a las 24 h, alcanza un máximo a las 40 h que comienza a disminuir, pero aún es visible tras las 48 h de la hepatectomía.
Los resultados de expresión de genes marcadores del ciclo celular avalan el modelo de HP, ya que los momentos en los que estos genes se expresan son coincidentes con las duraciones de las diferentes etapas del ciclo celular de los hepatocitos tras HP. Como se describe en la revisión de Fausto (2000), la fase de primado (G0/G1) se corresponde con las primeras 4 h posteriores a la HP; la fase de progresión (G1/S) continúa hasta las 20 h (donde comienza la fase S), y aproximadamente 48 h después de la operación, la primera ronda replicativa concluye. En este trabajo, se ha detectado la expresión de la ciclina E2 implicada en la transición G1/S a partir de las 20 h, y la ciclina B1 de detectó de forma más tardía, ya que esta proteína participa en la transición G2/M.
A pesar de que tras la HP todos los tipos celulares del hígado participan en el proceso regenerativo, estos lo hacen a diferentes tiempos, sin solapamiento significativo en la proliferación de un tipo celular con el siguiente (ver Figura 11 de Introducción). Esto hecho asegura que, si los análisis que se desee llevar a cabo se realizan dentro de las 48h posteriores a la HP, los resultados obtenidos serán representativos de eventos ocurridos dentro de la población de los hepatocitos.
Por tanto, los datos obtenidos en la tinción inmunohistoquímica anti-BrdU y en la determinación de la ventana temporal de expresión de las ciclina E2 y ciclina B1, sostienen el modelo de hepatectomía parcial como un modelo de proliferación celular sincronizada in vivo con la que poder llevar a cabo estudio relacionados con el ciclo celular.
2. Expresión de Gas1 en hígado.
2.1 Patrón de expresión de Gas1 a lo largo del ciclo celular del hepatocito.
GAS1 es una molécula pleiotrópica que participa en diversos procesos celulares, que dependen del tipo celular, del estadío de desarrollo o del contexto en el que las células se encuentran. Por ejemplo, Gas1 parece ser un gen marcador de quiescencia que detiene el ciclo celular antes de que la célula entre en fase S del ciclo celular (Cowled et al., 1994). Parece estar involucrado en el desarrollo embrionario del ratón (revisado en Martinelli and Fan, 2007) y se propone como un gen supresor de tumores susceptible de ser utilizado en terapias génicas contra melanoma (Gobeil et al, 2008) o tumores cerebrales (Zamorano et al, 2003). Sin embargo, hasta la fecha no han sido publicados datos sobre la posible participación de Gas1 en el control del ciclo celular en tejidos adultos sanos. De manera que, puesto que el hígado es un órgano quiescente en su estado fisiológico normal, nos preguntamos si Gas1 podría estar participando en el mantenimiento de dicho estado quiescente y cómo se vería afectado este gen en condiciones proliferativas.
En la Figura 27 A y B se muestra el patrón de expresión génica de Gas1 medido por RT-PCR y RT-PCR cuantitativa. Aquí puede observarse que en hígado quiescente la expresión de Gas1 es elevada, y disminuye tan pronto como 30 min después de la HP, para alcanzar un mínimo entre las 6 y las 8 h post-HP. Sin embargo, la expresión de Gas1 se reanuda a las 12 h para alcanzar un pico máximo a las 24 h, el cual desciende a las 48 h y vuelve a incrementarse al tercer día. Los controles de estrés operatorio (sham-operated) muestran que el proceso quirúrgico no afecta de forma considerable la expresión del gen bajo estudio.
Desconocemos la función que puede estar desempeñando la expresión de Gas1 pasadas las 24 h de HP. Dicha expresión fue sorprendente, puesto que en ese punto los hepatocitos se encuentran en plena transición G1/S del ciclo celular. Por tanto, la expresión de Gas1 no era previsible que se reanudara hasta finalización de la primera ronda replicativa deteniendo el ciclo celular de aquellos hepatocitos que debían cesar su proliferación.
GAS1 es una proteína de tipo GPI por lo que, para llevar una señal antiproliferativa al interior celular debería hacerlo a través de la interacción con otras proteínas, secuestrando e inhibiendo al receptor tirosina-quinasa RET, o bien secuestrando al ligando SHH e inhibiendo la ruta de señalización activada por éste.
Es posible que la expresión de Gas1 en este punto forme parte de un mecanismo de protección celular. Dada la importancia de la transición G1/S, es posible que la célula se prepare para responder de forma rápida ante algún problema intra- o extra-celular que requiera la detención del ciclo celular antes de comenzar la síntesis de DNA. Pero para que esto ocurriera, alguna señal que informara a la célula que debe detener su ciclo celular sería necesaria. Esta información podría mantener la expresión de GAS1 o activar la expresión de algún compañero inhibidor que actuara junto e él. Si esta señal no llegara a la célula, ésta seguiría su curso a través del ciclo celular y la expresión de GAS1 caería, como ocurre de hecho en nuestros experimentos.
Con el objetivo de analizar la posible relación entre Gas1 y ret en el control del ciclo celular del hepatocito, se determinó el patrón de expresión de éstos tras HP. La Figura 28 muestra que, cuando la expresión de ret alcanza su máximo, la de Gas1 alcanza su mínimo. De manera que es posible que la activación de RET sea necesaria para que el ciclo celular del hepatocito prosiga, ocurriendo este suceso en ausencia de GAS1.
Dada la estricta regulación transcripcional observada a lo largo del ciclo celular de Gas1, decidimos centrar nuestros esfuerzos en la caracterización del promotor proximal de dicho gen con el objetivo de profundizar en los mecanismos responsables del control transcripcional. Para ello, se eligieron tres condiciones representativas de diferentes estados transcripcionales del gen para realizar los subsiguientes análisis. Los puntos elegidos fueron: 0 h, donde existe una expresión constitutiva de Gas1 en quiescencia; 7 h post-HP, donde existe una represión transcripcional; y 24 h, donde se encontró activación transcripcional durante la transición G1/S (Figura 29).
2.2 Transcripción del gen Gas1 en tiempo real, tras hepatectomía parcial.
Dado que los resultados mostrados hasta el momento brindan información acerca del nivel estacionario del mRNA, se realizaron estudios para determinar la transcripción en tiempo real de Gas1 en los tres tiempos seleccionados tras HP. La técnica que utilizamos fue la RNApol ChIP cuyos resultados se muestran en la Figura 30. Allí puede observarse que la transcripción del gen Gas1 sigue el mismo patrón encontrado para los niveles de mRNA a las 0, 7 y 24h post-HP.
2.3 Niveles de la proteína GAS1 tras hepatectomía parcial.
Para comprobar si la síntesis de la proteína GAS1 tenía lugar en los tiempos analizados, se analizaron por Western blot los niveles de dicha proteína en los tres tiempos seleccionados. La Figura 31 muestra que los niveles de proteína siguen el mismo patrón que los niveles de mRNA medido por RT-PCR y la transcripción en tiempo real evaluada por RNApol ChIP.
3. Análisis del promotor de Gas1.
3.1 Modificadores y remodeladores de la cromatina en el promotor de Gas1.
A través de la técnica de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), se determinó el reclutamiento de complejos modificadores y remodeladores de la cromatina en el promotor de Gas1. La Figuras 33 y 34 muestran el análisis de la unión al promotor de Gas1 de las histona acetil-transferasas GCN5, CBP, p300 y PCAF; de los complejos histona desacetilasa mSIN3A y NCoR; y de los complejos remodeladores de la cromatina de las familias SWI/SNF, ISWI y CHD. Dichos análisis muestran que la GCN5 se encuentra unida al promotor mayoritariamente a las 0h en hígado control, mientras que la CBP lo hace en los tres tiempos analizados. No se detectó la presencia de p300 y PCAF en el promotor de Gas1. Por otro lado, el complejo NCoR se encontró unido en los tres tiempos analizados, mientras que mSIN3A lo hizo con gran intensidad a 0h, con intensidad media a7h y con intensidad baja a 24 h.
Por lo tanto, estos resultados indican que los niveles de acetilación de las histonas en el promotor de Gas1 parecen estar controlados por la actividad de las HAT GCN5 y CBP y las HDAC mSIN3A y NCoR, en las condiciones analizadas.
Respecto a los complejos remodeladores de la cromatina, el análisis realizado permitió identificar la presencia de la subunidad catalítica BRM de la familia SWI/SNF a las 24h post-HP, mientras que la subunidad catalítica SNF2h de la familia ISWI se encontró en hígados control. No se detectó la presencia de MTA1 en ninguno de los tiempos analizados.
Los resultados anteriormente comentados muestran una unión diferencial de complejos remodeladores de la cromatina cuando el gen Gas1 está siendo transcrito activamente. Este hecho podría estar relacionado con la remodelación de los nucleosomas para permitir la unión de factores transcripcionales, cuyos sitios de unión se encontrarían ocultos por el DNA en los nucleosomas y que serían necesarios para la activación transcripcional. Este evento remodelador consistiría en un posible desplazamiento nucleosomal, la eliminación de un nucleosoma concreto, o haciendo que el DNA que rodea al octámero de histonas esté más laxamente arrollado alrededor del mismo.
3.2 Posicionamiento nucleosomal en el promotor de Gas1.
Dada la presencia de remodeladores de la cromatina en el promotor de Gas1 cuando el gen se encuentra en transcripción activa, decidimos determinar el posicionamiento nucleosomal en los alrededores del inicio de transcripción. El objetivo de este aparado era determinar si ocurría algún cambio en este posicionamiento y correlacionarlo con la actividad transcripcional.
En la Figura 36A se muestran los resultados del análisis de posicionamiento nucleosomal teórico, llevado a cabo con el programa informático PHASE, desde la posición -500 hasta la +300, respecto al inicio de transcripción. Se muestra también los resultados del posicionamiento nucleosomal determinado empíricamente mediante dos metodologías complementarias: el ensayo de protección frente a la nucleasa de micrococo, y la inmunoprecipitación de mononucleosomas. Estos resultados son coincidentes ya que existen tres nucleosomas situados alrededor de las regiones -400, -200 y +150, que denominamos nucleosomas N-3, N-2 y N+1. Del mismo modo, se determinó que el nucleosoma N+1 sufría un desplazamiento cuando el gen se transcribe activamente (a 0h y 24 h post-HP). Este resultado concuerda con estudios previos que demuestran que en los genes transcritos el nucleosoma N+1 está desplazado hacia la región 3' del gen, lo que podría estar relacionado con el paso de la RNA polimerasa a través de esa zona (Schones at al 2008).
Por otro lado, la ausencia de nucleosomas en la zona que precede al inicio de transcripción concuerda con el hecho de que allí se ensambla el complejo de pre-iniciación de la transcripción, que incluye a la RNA polimerasa II, y que excluye la formación de nucleosomas. La unión de la RNA polimerasa en el promotor se muestra en la Figura 37 A para los tres tiempos analizados. Incluso a 7h, cuando la transcripción del gen se encuentra reprimida, se detecta la unión de la enzima en el promotor. Esto no es un evento raro, puesto que en muchos genes cuya expresión está regulada y debe activarse en función de demandas celulares, suelen poseer la RNA polimerasa II pausada, esperando las señales correctas para iniciar el proceso de elongación de la transcripción. De hecho, tal y como demostró Rougvie et al. (1988), nosotros hemos encontrado que la RNA polimerasa estaba pausada a las 7 h en una región subyacente y posterior al inicio de transcripción (ver Figura 37 B).
3.3 Modificaciones de histonas a nivel mononucleosomal.
A través de la técnica Nuc-ChIP, en la que se inmunoprecipitan con anticuerpos específicos mononucleosomas obtenidos por digestión con la nucleasa de micrococo, se realizó el análisis de un grupo de modificaciones de histonas presentes en los nucleosomas N-3, N-2 y N+1. Un resumen de todas las modificaciones de histonas estudiadas en los diferentes nucleosomas y en los diferentes estadíos transcripcionales de Gas1 tras HP se muestras en las Figuras 41 y 43. Aquí puede verse una distribución diferencial para ciertas modificaciones respecto al nucleosoma concreto estudiado y en relación al estado transcripcional específico del gen. Así, por ejemplo, la acetilación de la lisina 9 de la histona H3 parece ser una marca del N+1 a 0h, mientras que la acetilación de la lisina 5 de la histona H4 se encontró en el N-3 en los tres tiempos estudiados. Por otro lado, la di-metilación de la arginina 3 de la histona H4 mostró un claro patrón relacionado con el estadío de actividad trancripcional a 24h post HP, encontrándose mayoritariamente modificados los tres nucleosomas estudiados.
3.4 Unión de factores transcripcionales.
En este apartado se analizó la unión de un grupo de factores transcripcionales relacionados con el control de la proliferación celular al promotor de Gas1. Se comprobó, mediante el uso de dos programas informáticos de predicción de sitios de unión a DNA, si dichos sitios de unión de factores estaban presentes en la secuencia de DNA del promotor de Gas1. Los factores analizados fueron: SMAD4, C/EBPß, CREB, NF-kB, P-ELK1, ATF2, ATF3, ETS2, SP1 y p53. La Figura 45 muestra los resultados de unión de los factores transcripcionales seleccionados. Se encontró a los factores SMAD4, C/EBPß, CREB y ETS2 unidos al promotor en hígados control (0h), a SP1 y P-ELK1 a las 7 h, y a NF-kappa B y ATF2 a las 24 h post HP.
Dado la existencia de una unión diferencial de factores cuando el gen Gas1 se transcribe (0 y 24 h), esto significaría que diferentes rutas de señalización están directamente implicadas en la regulación de dicha transcripción. Así, es posible que la vía de señalización inducida por TGF-ß podría sea la responsable de activar la transcripción de Gas1 en quiescencia, mientras que a las 24 h, alguna vía que involucre la activación de NF-kappaB podría se la implicada en la activación del gen en la transición G1/S.
La Figura 47 muestra un esquema resumen donde se propone un hipotético modelo de regulación transcripcional a partir de los datos empíricos obtenidos.
4. ¿Puede GAS1 bloquear la proliferación de células de hepatocarcinoma? 4.1 Análisis in vitro.
Tras caracterizar el promotor de Gas1 en los diferentes estados transcripcionales estudiados, nos propusimos averiguar si las potenciales capacidades antiproliferativas de GAS1 podían ser utilizadas como herramienta en la terapia génica anti-tumoral hepática. Para ello, se analizó el efecto de la sobreexpresión de este gen en una línea celular de hepatocarcinoma de ratón, Hepa 1-6.
Antes de realizar dicho análisis, se realizaron diferentes optimizaciones metodológicas. Entre ellas, se optimizó el método de transfección para poder, posteriormente, incorporar y sobreexpresar el transgén. La condición experimental que mostró un mayor porcentaje de transfección, cuantificado por el % de células que expresaban el gen reportero para la proteína GFP, se correspondió con el ensayo realizado con el reactivo Lipofectamine 2000, utilizando la cantidad de DNA plasmídico recomendada por el fabricante, pero el doble de reactivo aconsejado (Figuras 48 y 49).
Por otro lado, también se analizó qué promotor era más adecuado, CMV o CAG, para inducir una mayor sobreexpresión en la línea celular Hepa 1-6. Para ello, se construyeron dos vectores de sobreexpresión con el gen de la luciferasa como reportero, bajo el control ce los promotores CMV y CAG. Para cuantificar qué promotor era capaz de inducir una mayor expresión del transgén, se realizó un ensayo de luminometría para cuantificar la bioluminiscencia generada en extractos celulares procedentes de células transfectadas con los vectores previamente generados. La Figura 50 muestra que el promotor CAG guía una expresión de la luciferasa 14 veces superior respecto al promotor CMV.
Una vez determinado el protocolo de transfección más adecuado y el promotor para inducir una expresión más fuerte, se construyó un vector para sobreexpresar GAS1 bajo el control del promotor CAG. Un factor que se tuvo en consideración fue las células en quiescencia por privación de suero o inhibición por contacto, poseen una expresión endógena de GAS1. Por ello, al vector de sobreexpresión se le incorporó una etiqueta (el epítopo HA), para que al traducirse la proteína GAS1 ésta llevara el epítopo incorporado en el extremo N-terminal. De esta forma, la proteína etiquetada exógena podría ser distinguida de la endógena. El análisis por Western blot muestra que la proteína HA-GAS1 se expresa correctamente en células transfectadas con el vector pcDNA3/CAG-HaGas1 (Figura 51).
Una vez generado el vector para sobreexpresar HA-GAS1, se analizó qué efecto tenía la sobreexpresión sobre el ciclo celular en la línea Hepa 1-6. Para ello, se determinaron los niveles de ciclina E2 por RT-PCR y RT-PCR cuantitativa, como se muestra en la Figura 52. Los resultados muestran que la expresión de este gen cae un 60% en células tras 15 h de ser transfectadas con el vector de sobreexpresión de HA-GAS1.
Por otra parte se determinó si la sobreexpresión de GAS1 era capaz de bloquear la síntesis de DNA, tal y como habían mostraron Del Sal et al. (1992), sobreexpresando el gen en fibroblastos en cultivo. Para ello, analizamos una doble tinción inmunohistoquímica -HA/-BrdU.
Tras poner a punto cada inmunotinción por separado, y comprobar que la proteína GAS1 era correctamente expresada y enviada al exterior celular (ver Figuras 53 y 54), se realizó la doble tinción anti-HA/BrdU (Figura 55). Aquí, las células positivas para HA (en color verde) son negativas para BrdU (con núcleo en color azul), lo que confirmaría que las células que expresan HA-GAS1 tienen bloqueada la síntesis de DNA puesto que no incorporaron BrdU.
Para confirmar el anterior resultado, se analizó por citometría de flujo el ciclo celular tiñendo células control y células que sobreexpresaban GAS1 con ioduro de propidio. La Figura 56 muestra el descenso del número de células en fase S en el caso de muestras transfectadas con el vector de sobreexpresión de HA-GAS1, respecto al control. Sin embargo, hay que tener en cuenta que en esta determinación se está midiendo la cantidad de DNA presente en una mezcla de células transfectadas y no transfectadas. y que el proceso de fijación, permeabilización y tinción con ioduro de propidio afecta negativamente a la fluorescencia de la GFP, codificada en el mismo plásmido que codifica HA-GAS1. Por tanto, para superar este inconveniente se realizó una separación celular (cell sorting) para separar las células transfectadas GFP positivas, antes de fijarlas y teñirlas con ioduro de propidio y analizar su ciclo celular. De esta forma, la información obtenida de la tinción con ioduro de propidio será representativa únicamente de la población de células transfectadas. Este resultado se muestra en la segunda parte de la Figura 56.
Con los resultados obtenidos, puede afirmarse que la sobreexpresión de GAS1 inhibe la síntesis de DNA en le línea celular de hepatocarcinoma de ratón Hepa 1-6.
4.2 Análisis in vivo.
Tras comprobar que la sobreexpresión de Gas1 tenía la capacidad de detener el ciclo celular de la línea tumoral Hepa 1-6, nos preguntamos si este efecto antiproliferativo podría ocurrir in vivo en hígados en proliferación controlada, como ocurre tras la HP, y en condiciones de proliferación no controlada, como en el caso del desarrollo de hepatocarcinomas. De manera que, para llevar a cabo dicho objetivo, se optimizó la técnica de transfección hidrodinámica, la cual permite transfectar el hígado con DNA desnudo a través de una inyección presurizada en la cola del ratón. La Figura 57 muestra el incremento del porcentaje de transfección con cantidades crecientes de DNA inyectado determinado por la actividad ß-galactosidasa en hígado, codificada en el plásmido exógenamente incorporado. Por otra parte, la Figura 58 muestra una tinción X-gal de un hígado transfectado con la cantidad de DNA que, previamente, había generado el mayor porcentaje de tranfección (50 ¿g).
Siguiendo el mismo procedimiento del apartado anterior para el análisis in vitro, se estudió la capacidad de los dos promotores CMV y CAG para inducir la expresión luciferasa in vivo. Para ello, se comparó la bioluminiscencia generada en ratón transfectados mediante transfección hidrodinámica con los vectores dirigidos por promotores CMV y CAG. Se analizó por captura de imágenes de emisión de fotones en tiempo rea la señal luminosa emitida tras la administración del sustrato de la luciferasa. La cuantificación de los fotones emitidos muestra una diferencia similar a la observada in vitro, con el promotor CAG generando una expresión 12 veces mayor que con promotor CMV.
Otro de los parámetros analizados fue la disminución de la actividad luciferasa a lo largo del tiempo. En los ratones transfectados con los dos vectores se cuantificó la emisión de fotones a los 2, 7 y 21 días posteriores a la transfección. De los datos obtenidos pudo concluirse que el uso del promotor CAG es preferible respecto al CMV, cuando lo que se desea es una expresión en hígado fuerte y de duración moderada, al menos hasta 3 días.
Tras determinar que el promotor CAG era el más adecuado para inducir una sobreexpresión en hígado, se transfectaron hígados de ratón con el plásmido pcDNA3/CAG-HAGas1. Con ello se acometió la determinación , en primer lugar, de la vida media del plásmido en hígado tras la transfección, y a posteriomente la presencia de la proteína HA-GAS1 en los mismos tiempos. Así, en la Figura 61 A puede verse cómo el plásmido presenta una elevada concentración 1 y 3 días después de la inyección, mientras que a los 7 días esta concentración decae considerablemente, para mantenerse así hasta el día 17. Los niveles de mRNA y proteína HA-GAS1 también se determinaron a diferentes tiempos tras la inyección inicial (Figura 61 B y C).
Tras comprobar la permanencia de la proteína HA-GAS1 en hígado tras la transfección hidrodinámica, se decidió analizar el efecto de su sobreexpresión en hígados a los que se les indujo la producción de tumores por administración del carcinógeno DEN. Esta sustancia es capaz de generar hepatocarcinoma 35 semanas después de su administración inicial, 15 días después del nacimiento del ratón. Así, para comprobar el efecto que podría ejercer Gas1 sobre este proceso, se inyectó por transfección hidrodinámica el plásmido pcDNA3/CAG-HAGas1 una vez a la semana, desde la semana 28 hasta la semana 35, en la que se sacrificó a todos los animales de experimentación. Un grupo control recibió las inyecciones en las mismas condiciones, pero sólo con solución salina.
La Figura 62 B muestra imágenes de hígados DEN inyectados con solución salina (izquierda) y Gas1 (derecha). A simple vista es posible apreciar la diferencia en el tamaño y aspecto de los tumores. En el grupo Gas1 los tumores presentan un aspecto más encapsulado y de menos tamaño, mientras que el grupo control presenta hígados con aspecto más sanguinolento (mayor vascularización) y tumores con morfologías menos definidas. Además de estos parámetros cualitativos, se analizaron parámetros cuantitativos, como el númer y tamaño de tumores presentes en los dos lóbulos mayores del hígado, como así también la expresión de tres genes marcadores de hepatocarcinoma, utilizados como biomarcadores para la detección de esta dolencia debido al incremento de sus niveles en suero. Los datos obtenidos muestran que el número total de tumores es prácticamente el mismo en ambos grupos, pero que el tamaño de los mismos difiere entre los mismos. Así, el grupo que recibió el tratamiento con Gas1 presentó tumores de menor tamaño respecto al control, lo que podría estar indicando el papel de Gas1 en la inhibición de la proliferación de tumores emergentes, o la inducción de apoptosis en tumores ya formados (hecho que se comprobará con posterioridad). La diferencia encontrada fue estadísticamente significativa.
La Figura 62 E y F muestra que el grupo que recibió el tratamiento con Gas1 presenta la expresión de los genes marcadores elegidos (AFP, GGT y IGF-II) disminuída respecto al grupo que sólo recibió inyecciones de solución salina, lo que parece sugerir un papel regulador en el desarrollo de la malignidad de los tumores por parte de Gas1.
Los datos provenientes de los análisis realizados con células de hepatocarcinoma de ratón Hepa 1-6, y los resultados obtenidos in vivo utilizando ratones con tumores hepáticos parecen indicar que Gas1 es capaz de afectar negativamente el desarrollo de hepatocarcinoma in vivo, y puede ser tenido en cuenta como una potencial herramienta en protocolos de terapia génica antitumoral.
IV. CONCLUSIONES 1. La expressión del gen Gas1 se encuentra estrictamente regulada a lo largo del ciclo celular del hepatocito en el modelo de proliferación celular in vivo inducido por hepatectomía parcial. El gen se expresa bajo condiciones de quiescencia celular, se reprime durante la transición G0/G1 , y su expresión se reanuda antes de la entrada en fase S del ciclo celular.
2. La transcripción en tiempo real del gen sigue el mismo patrón que los niveles estacionarios de su mRNA en los puntos analizados, y confirma el hecho que Gas1 se halla regulado a nivel transcripcional.
3. La regulación transcripcional de Gas1 se logra a través de una compleja combinación de actividades de complejos activadores/represores reclutadas en su promotor, como así también de la compleja red de modificaciones de histonas que ayudan a orquestrar la respuesta transcripcional final. Entre las características analizadas del promotor de Gas1 se encontró que:
3.1 Las Histona-Acetiltransferasas CBP y GCN5 se encontraron unidas al promoter de Gas1, estando CBP presente en los tres estadíos transcripcionales analizados (transcripción constitutiva, represión y activación), mientras que GCN5 sólo se encontró en condiciones de expresión constitutiva.
3.2 Los complejos con actividad Histona desacetilasa N-CoR y mSin3A se encontraron unidas al promotor en las tres condiciones analizadas.
3.3 Dos complejos remodeladores de la cromatina distintos fueron diferencialmente reclutados al promotor de Gas1 cuando la actividad del gen fue elevada: la subunidad catalítica de la familia de remodeladotes ISWI, SNF2h, se detectó durante la transcripción basal del gen; mientras que BRM, la subunidad catalítica de la familia SWI/SNF, se encontró en condiciones de activación transcripcional.
3.4 El posicionamiento nucleosomal empíricamente determinado en la cercanía del inicio de transcripción del gen Gas1 mostró una correspondencia con la predicción informática de ocupación de nucleosomes en esa zona, basada en la secuencia del DNA. N-3 ocupa una posición cercana a -400, N-2 se localiza alrededor de -200, y N+1 mostró un desplazamiento dependiendo del estadío transcripcional. Cuando la expresión de Gas1 se halla reprimida, N+1 conserva una posición más fija alrededor de +125, mientras que en condiciones de elevada actividad transcripcional, el N+1 de desplaza hacia la región +200.
3.5 La RNA pol II presentó una configuración pausada por debajo del sitio de inicio de transcripción del gen, en condiciones de represión.
3.6 BRM fue detectado sobre los nucleosomes N-3 y N+1 en condiciones de activación transcripcional, mientras que SNF2h se detectó sobre N-3 en condiciones de transcripción basal.
3.7 Las modificaciones de histonas mostraron un patrón diferencial sobre diferentes nucleosomes y sobre distintas condiciones transcripcionales. Así, marcas específicas parecen estar relacionadas con nucleosomas específicos y/o actividades transcripcionales puntuales. H3K9ac parece ser una marca específica de N+1 en transcripción constitutiva; H4R3me2 apareció mayormente asociada con la activación transcripcional sobre los tres nucleosomes analizados; H3K9me3 apareció asociada al N-3 en las tres condiciones transcripcionales estudiadas; mientras H3K14ac, H3K27ac and H3K4me3 no mostraron significativos cambios en relación a los nucleosomes ocupados o en función de la actividad transcripcional, estando presentes en todos los nucleosomas y condiciones analizados.
3.8 Los factores de transcripción encontrados en el promotor de Gas1 durante condiciones de expresión constitutiva fueron SMAD4, ETS2, C/EBPß and CREB. Durante la activación transcripcional se encontraron ATF2 y NF-kB; mientras que durante la represión transcripcional SP1 y P-ELK1 se encontraron fuertemente unidos. De manera que, la transcripción basal podría estar regulada a través de la cascada se señalización activada por TGF-ß, la activación podría estar mediada por NF-kB y la represión por la cascada de las MAP kinasas u otras rutas de kinasas.
4. La sobre-expresión de Gas1 en la línea de hepatocarcinoma de ratón Hepa 1-6 inhibe la proliferación celular, antes de la fase de síntesis de DNA.
5. La sobre-expresión de Gas1 en hígado afecta negativamente el desarrollo de hepatocarcinoma celular inducido químicamente en ratón, disminuyendo el tamaño y la malignidad de los tumores.
