Amphipathic proline-rich cell-penetrating peptides: fron development to cargo transport
- Autores: Silvia Pujals Riatós
- Directores de la Tesis: Ernest Giralt Lledó (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2009
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Antonio Planas Sauter (presid.), Ernesto Nicolás Galindo (secret.), Florine Cavelier (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El desarrollo de fármacos exitosos implica muchos pasos, el más importante de los cuales es asegurar que el candidato a fármaco interaccione eficientemente con su diana. Una vez este hecho se consigue, se tienen que mejorar otros aspectos, como la selectividad, la estabilidad, la eliminación y la liberación. Para dianas localizadas en el interior celular, conseguir una liberación intracelular del fármaco es crucial. Desafortunadamente, la mayoría de los candidatos a fármaco son incapaces de cruzar la membrana citoplasmática. Una estrategia para transportar fármacos dentro de la célula es la utilización de secuencias peptídicas con la capacidad de translocar la membrana citoplasmática. Esta estrategia surgió en 1994, con el descubrimiento que la tercera hélice del homeodominio de la Antennapedia, pAntp(43-58), podía cruzar la membrana celular. Desde entonces, se han descubierto diferentes péptidos con esta capacidad, nombrados péptidos lanzadera (en inglés "cell-penetrating peptides", "CPPs"). En el presente trabajo se han utilizado una familia de péptidos lanzadera introducidos en el laboratorio del Prof. Giralt: los péptidos amfipáticos ricos en prolina. El mejor candidato como péptido lanzadera de esta familia fue el trímero de arginina, CF-(VRLPPP)3 (nombrado "Sweet Arrow Peptide", SAP). Las grandes ventajas de estos nuevos péptidos son su origen no viral, su elevada solubilidad en agua y la ausencia de citotoxicidad hasta concentraciones tan elevadas como 1 mM.
Se optimizó la estabilidad metabólica del péptido lanzadera, partiendo de la secuencia de SAP el nuevo derivado resistente a proteasas se consiguió mediante la síntesis con aminoácidos D, una configuración no susceptible a la degradación por proteasas. El péptido lanzadera con aminoácidos D se internaliza en células al mismo nivel que la versión con aminoácidos L, de manera que se puede concluir que el mecanismo de internalización es independiente de receptor. Se ha comprobado la mayor estabilidad metabólica del péptido con aminoácidos D, resultando ser completamente resistente a elevadas concentraciones de tripsina y frente a un 90% de suero humano. Contrariamente, el péptido con aminoácidos L se degrada rápidamente.
La estructura secundaria de los péptidos se ha estudiado mediante dicroísmo circular, confirmando la predicha estructura de poliprolina II. Además, estudiando los péptidos a distintas concentraciones se ha observado un comportamiento agregativo, pues a mayor concentración la elipticidad molar por residuo aumenta, hasta llegar a un punto (50 ¿M) donde esta permanece constante. Se han estudiado mediante microscopia de transferencia electrónica las estructuras de estos agregados, tratándose de fibras de unos 16 (±3) nm de amplitud y de alargada variable.
Además se han realizado experimentos de internalización a 4 °C y con inhibidores de la producción de ATP, viendo que el nivel de internalización disminuye considerablemente con su presencia. Estos resultados apuntan hacia un mecanismo de tipo endocítico, de manera que se han realizado estudios de colocalización para saber de qué tipo de endocitosis se trata. Así, se ha trabajado con dos proteínas cuyo mecanismo de internalización es conocido, la colera toxina, cuya internalización se da por endocitosis vía caveolas o lipid-rafts, y la transferrina, cuya internalización se da por endocitosis vía clatrinas: se ha comprobado que el péptido colocaliza con la colera toxina, es decir, que su ruta de internalización es vía caveolas o lipid-rafts.
Se escogió como cargo para SAP nanopartículas de oro, por su potencial aplicación en biotecnología y sus excelentes propiedades ópticas. Se han sintetizado Np Au, se les ha conjugado el péptido con una cisteína en N-t y se han caracterizado mediante distintas técnicas: espectroscopia visible, microscopia electrónica de transmisión, XPS, HRTEM-EELS, potencial zeta y DLS. Después se ha comprobado el transporte de las Np Au mediado por el péptido lanzadera en células HeLa por microscopía electrónica de transmisión, microscopía confocal de escaneo con láser y microscopía de rayos X de transmisión. En todos los casos se ha observado una clara internalización de las nanopartículas de oro, mientras que éstas sin péptido conjugado no son transportadas dentro de la célula. Se han realizado estudios de viabilidad a las 2 y 24h de incubación y en ambos casos la viabilidad ha sido superior al 90%, indicando que el tratamiento con nanopartículas no es tóxico. Por otro lado, en colaboración con el grupo de nanobiosensores de la Universidad Autónoma de Barcelona, se ha conjugado el péptido lanzadera a "quantum dots", puntos cuánticos, nanopartículas de sulfuro de cadmio con propiedades fluorescentes. Se han caracterizado los "quantum dots" unidos al péptido lanzadera mediante la medida del potencial zeta y con espectros de fluorescencia. Posteriormente se ha evaluado la internalización de los quantum dots con o sin péptido lanzadera en su superficie mediante microscopía confocal, pudiendo confirmar que la presencia del péptido es clave para la internalización de los "quantum dots". Finalmente se ha podido cuantificar la presencia de los quantum dots por detección electroquímica del cadmio mediante "screen-printed electrodes".
