MOLECULAR CHARACTER1ZATION OF CYTOSOLIC ALANINE AMINOTRANSFERASE GENE EXPRESSION IN GILTHEAD SEA BREAM (SPARUS AURATA) RESUMEN: La alanina aminotransferasa (ALT) cataliza de manera reversible la transferencia del grupo amino de la L-alanina al 2-oxoglutarato, dando lugar a la formación de piruvato y L-glutamato. A fin de profundizar en el conocimiento de la función ejercida por la isoforma citosólica de la ALT (cALT) en dorada (Sparus aurata), los objetivos de esta tesis han sido: i) clonar y caracterizar el promotor de cALT de dorada; ¡i) determinar los parámetros cinéticos de las isoformas de cALT; y iii) estudiar la regulación nutricional y hormonal de la expresión de cALT. El promotor de cALT fue aislado mediante paseo cromosómico sobre DNA genómico de dorada. La caracterización de dicho promotor ha permitido delimitar el núcleo mínimo con actividad promotora y el papel de diversos factores de transcripción y proteínas coactivadoras, como p300, c-Myb y USF2a, sobre la actividad transcripcional del gen cALT. Ensayos de RT-PCR y RACE PCR han permitido aislar una nueva isoenzima (cALT2), que se genera por procesamiento alternativo del gen cALT de dorada. La expresión de cALT2 como una proteína fusionada a la proteína verde fluorescente (GFP) en células HEK293 ha permitido demostrar, mediante microscopía confocal de fluorescencia, que cALT2 localiza en el citosol. La función metabólica de las isoformas cALT1 y cALT2 en hígado de dorada se estudió mediante la caracterización cinética de ambas isoenzimas tras su expresión en Saccharomyces cerevisiae, y el análisis de la modulación de su expresión hepática en doradas sometidas a diversas condiciones nutricionales. El análisis cinético indica que cALT2 es más eficaz en la catálisis de la conversión de L-alanina a piruvato que cALT1. El ayuno estimula la expresión hepática de cALT2, mientras que disminuye la de cALT1. La alimentación y el tratamiento con glucosa e insulina promueven los efectos contrarios al ayuno sobre la expresión de ambas isoenzimas. Considerados en su totalidad, los resultados obtenidos muestran que la expresión de cALT2 aumenta en hígado en condiciones asociadas a gluconeogénesis, mientras que la de cALT1 está más relacionada con la utilización postprandial de los nutrientes de la dieta. Por otra parte, estudios recientes asocian un incremento de la actividad ALT en sangre, dentro del rango considerado normal, con las fases iniciales del desarrollo de la diabetes de tipo 2 en humanos. El hecho de que nuestros estudios muestran un incremento de la expresión hepática de cALT2 en hígado de doradas con diabetes inducida por tratamiento con estreptozotocina, sugiere que la expresión hepática de esta enzima podría ser utilizada como un marcador eficaz en la patogénesis de la diabetes en humanos.
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