Resumen de El transporte de arginina en los macrófagos y la susceptibilidad th1/th2
Según el tipo de respuesta inmunitaria que se desarrolle, un mismo organismo patógeno puede generar cuadros clínicos diferentes. Ejemplo de ello es la infección por Mycobacterium Leprae. Ciertos individuos generarán un cuadro de Lepra Tuberculoide; se caracteriza por la formación de granulomas que eliminan eficazmente el parásito pero conlleva la destrucción masiva de los tejidos, provocando en los individuos que la padecen mutilaciones progresivas de las extremidades. En cambio, los individuos que desarrollan el subtipo de lepra lepromatosa no forman granulomas, con lo que no se destruyen los tejidos pero no se logra eliminar al parásito lo que conlleva a una afectación sistémica mucho más grave que en el caso anterior. Se había visto que en los tejidos afectados de individuos que desarrollaban la lepra tuberculoide predominaban citocinas de tipo I como IFN-y e IL-2, en cambio en los tejidos afectados procedentes de los individuos que desarrollaban lepra lepromatosa predominaban citocinas de tipo 2 como la IL-4 o la IL-10. Existen modelos murinos con tendencia a desarrollar una respuesta de tipo Th1 o Th2 como es C57bI6 y BaIb-c respectivamente. De forma similar a lo que acontece en humanos respecto a la Lepra, los ratones de ambas cepas desarrollan un tipo de respuesta inmune diferente frente a un mismo parásito como es la Leishmania sp. O Tripanosoma sp.
Hemos utilizado como modelo experimental macrófagos derivados de médula ósea de ambas cepas. Dependiendo de las citocinas en el micrambiente celula, los macrófagos derivados de médula ósea se activan mediante la vía clásica o bien alternativa. Citocinas de tipo Th1 como el IFN-y o componentes de la membrana bacteriana como el LPS inducirán la activación clásica de los macrófagos. En cambio, citocinas de tipo Th2 como la IL-4 o IL-13 entre otras inducirán la activación alternativa. Ambas vías difieren en la metabolización de la L-arginina. Mediante la activación clásica se inducirá la enzima NOS2 que metabolizará la L-arginina a óxido nítrico, entre otras moléculas efectoras proinflamatorias. En cambio, mediante la activación alternativa se inducirá la ezima arginasa, que matabolizará la L-arginina en poliaminas y colágeno, moléculas necesarias para la reparación tisular.
Activando los macrófagos de ambas cepas mediante citocinas de tipo TH1 o TH2 no observamos diferencias ni en la actividad ni en el nivel de expresión de NOS2 ni de arginasa. En cambio observamos que el catabolismo de la arginina era superior en la cepa Balb-c así como el transporte de arginina. El transporte de arginina en macrófagos se correlacionaba con los niveles de expresión del transportador de arginina Cat-2. Así mismo observamos que los macrófagos de la cepa Balb-c expresaban niveles mayores de Cat-2 que los de la cepa c57/b16.
El transportador Cat-2 se expresaba en forma de dos isoformas que se diferenciaban en el tamaño y la localización subcelular que depende del exón 1 que utilicen y el lugar de poliadenilación. La isoforma de mayor tamaño (9kB) y el lugar de poliadenilación distal. Ésta se retiene en el núcleo en una estructura subnuclear llamada Paraspeckle. Mediante determinados estímulos éste RNA retenido se libera de éstas estructuras y pasa al citoplasma. En cambio la isoforma de menor tamaño (4,4 kB) utiliza el exón 1D y el lugar de poliadenilación proximal. Existían diferencias en la expresión de ambas isoformas que no eran debidas a un incremento de la estabilidad, como se comprobó mediante tratamiento con un inhibidor transcripcional, sino a una actividad transcripcional diferencial.
Se localizó la región reguladora de la isoforma de mayor tamaño que comprendía una región de 1000 pares de bases al inicio del exón A. Se amplificó por PCR esta región a partir de ADN genómico de ambas cepas y se observó que la cepa C57/b16 tenía una delección de 4 pares de bases. Esta delección provocaba la ruptura de un palíndromo perfecto en comparación a la región genómica de Balb-c. Mediante estudios funcionales de esta región, que consistía en el clonaje de esta región reguladora en pauta a un gen reporter, se observó que estos 4 nucleótidos eran críticos para la actividad e industibilidad de esta región. Así mismo mediante la fragmentación de ésta zona reguladora unida al gen reporter se observó que había otros elementos reguladores de la actividad funcional de esta región.
Finalmente mediante ensayos de retardo en gel se observó que se formaban complejos protéicos diferentes en la cepa c57/b16 que contenía la delección respecto a la cepa Balb-c, pero no fue posible discernir qué proteínas estaban formando parte de éstos complejos. No obstante, la formación de éstos complejos dependía de la región genómica considerada y no de la procedencia de los extractos nucleares (Balb-c o C57/b16). Una inhibición de las proteínas que se unen a la región palindrómica podría construir una terapia eficaz para reducir la respuesta de tipo Th2 responsable de procesos patológicos como el asma o enfermedades inflamatorias.
